HPLC內標法同時測定芪麝丸中9種成分

杜思邈， 潘一峰， 張 寧*

(1.上海中醫藥大學，上海201203;2.上?，F代中醫藥股份有限公司，上海200051)

芪麝丸由黃芪、川芎、青風藤、粉防己等多味藥組成，具有益氣化瘀、祛風通絡、舒筋止痛的作用。黃芪［1］為方中君藥，其黃酮類成分具有改善血液循環，提高免疫力的作用，其中毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、芒柄花苷為其主要有效成分。川芎［2］同樣為本方的君藥，其中萜類成分 (如洋川芎內酯I、洋川芎內酯A)為其辛香行散，溫通血脈作用的主要有效成分。粉防己［3］、青風藤［4］為方中佐藥，其中生物堿類成分(如粉防己堿、防己諾林堿、青藤堿)為其祛風除濕，利水消腫止痛作用的主要有效成分。文獻報道的有關上述9種成分的定量測定方法有薄層掃描法［5］、紫外分光光度法［6］、旋光法［7］、高效液相色譜法［8-11］、非水毛細管電泳法［12］等。

本實驗建立了HPLC梯度洗脫內標法同時測定制劑中的毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、芒柄花苷、洋川芎內酯I、洋川芎內酯A、粉防己堿、防己諾林堿、青藤堿9種成分，方法簡便，精確度高，對于采用多成分監控復方制劑的質量具有參考價值。

1 儀器與試藥

Agilent1200高效液相色譜儀。甲醇 (色譜純，Spectrum公司);娃哈哈純凈水 (杭州娃哈哈集團，批號20110303);其余試劑均為分析純。芪麝丸 (上海黃海制藥有限公司，批號分別為100601、100602、101101);洋川芎內酯 I對照品 (自制，油狀物，經1H-NMR、13C-NMR、IR、UV、MS鑒定為洋川芎內酯I，純度為98%);毛蕊異黃酮對照品 (四川省維克奇生物科技有限公司，批號201104);毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品 (四川省維克奇生物科技有限公司，批號201101，純度≥98%);芒柄花素對照品 (四川省維克奇生物科技有限公司，批號201005，純度≥98%);芒柄花素苷對照品 (四川省維克奇生物科技有限公司，批號201006，純度≥98%);洋川芎內酯A對照品(四川省維克奇生物科技有限公司，批號201103，純度≥98%);粉防己堿對照品 (中國藥品生物制品檢定所，批號711-9304，含量測定用);防己諾林堿對照品 (中國藥品生物制品檢定所，批號0793-9203，含量測定用);青藤堿對照品 (中國藥品生物制品檢定所，批號0774-200206，含量測定用);異補骨脂素對照品 (中國藥品生物制品檢定所，批號110738-200511，含量測定用)。

2 色譜條件

Kromasil C18色譜柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相為乙腈-0.2%甲酸水溶液梯度洗脫;體積流量0.8 mL/min;測定波長262 nm;柱溫30℃，梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫順序Tab.1 Gradient elution mode

在乙腈-0.2%甲酸水溶液梯度洗脫的色譜條件下，進行了內標物的篩選，嘗試了龍膽苦苷、芍藥苷、異補骨脂素等多種物質，其中異補骨脂素的保留時間較合適，且與其他9種物質在此條件下均可達到與基線分離，峰形對稱，又因本制劑樣品中不含異補骨脂素，故選定異補骨脂素為HPLC法的內標物。

3 實驗方法與結果

3.1 供試品溶液的制備 本品研細，取1g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加適量甲醇超聲50 min，放冷后加甲醇至刻度;另取10 mL量瓶，精密加入內標異補骨脂素溶液 (0.1 mg/mL)1 mL，再加入芪麝丸樣品溶液至刻度，搖勻，微孔濾膜濾過后進樣。見圖1。

圖1 加內標的芪麝丸樣品色譜圖Fig.1 Chromatogram ofQishePillsamplewith internal standard

3.2 內標溶液的制備 精密稱取于五氧化二磷干燥器中干燥至恒質量的異補骨脂素對照品10 mg置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成每1 mL含0.1 mg的內標溶液。

3.3 線性關系考察 精密稱取各對照品一定量，置同一10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制成混合對照品標準貯備液，并分別稀釋配成不同質量濃度的混合對照品系列溶液，見表2。混合對照品液相色譜圖見圖2。

表2 各對照品溶液的質量濃度 /(μg·mL-1)Tab.2 Concentration of reference substances/(μg·mL-1)

圖2 混合對照品色譜圖Fig.2 Chromatogram of mixed reference substances

精密吸取上述對照品溶液各1 mL，分別置于10 mL量瓶中，精密加入內標異補骨脂素溶液(0.1 mg/mL)0.2 mL，加甲醇稀釋至刻度，即得系列混合標準溶液，進行高效液相色譜儀測定，進樣量10 μL。以對照品峰面積與異補骨脂素內標峰面積的比值 (Ag/As)為縱坐標 (Y)，相應對照品質量濃度 (C，μg/mL)為橫坐標 (X)，繪制標準曲線，得相應對照品的回歸方程。結果見表3。3.4 內標法校正因子的測定 精密吸取混合對照品貯備液1.0、4.0、8.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，精密加入異補骨脂素內標液 (0.1 mg/mL)0.2 mL，加甲醇定容，搖勻，濾過即得。高效液相色譜儀測定對照品及內標物質的峰面積，進樣量10 μL，計算9種對照品校正因子。結果見表4。

表3 各對照品的線性關系Tab.3 Linear relationships of reference substances

3.5 空白試驗 分別將原方中去除川芎、黃芪、防己、青風藤藥材，按制劑工藝方法制備分別得到4種陰性制劑。分別取0.1 g陰性制劑，加甲醇25 mL超聲溶解，按定量測定方法分析，4種陰性樣品色譜在毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、芒柄花素苷、洋川芎內酯I、洋川芎內酯A、粉防己堿、防己諾林堿、青藤堿相應保留時間位置無干擾峰。見圖3～6。

表4 各對照品對異補骨脂素的相對校正因子測定結果Tab.4 Relative calibration factor test results of different reference substances to isopsoralen

圖3 缺黃芪的陰性制劑色譜圖 (加內標物)Fig.3 Chromatogram of Qishe Pill sample without Astragali Radix(including internal standard)

圖4 缺川芎的陰性制劑色譜圖 (加內標物)Fig.4 Chromatogram of Qishe Pill sample without Chuanxiong Rhizome(including internal standard)

圖5 缺防己的陰性制劑色譜圖 (加內標物)Fig.5 Chromatogram of Qishe Pill sample without Stephaniae tetrandrae Radix(including internal standard)

圖6 缺青風藤的陰性制劑色譜圖 (加內標物)Fig.6 Chromatogram of Qishe Pill sample without Sinomenii Caulis(including internal standard)

3.6 穩定性試驗 同一樣品 (批號101101)供試液，測定0、2、4、6、8、10、12、24 h樣品中有效成分，測定峰面積。結果表明，供試液中毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、芒柄花素苷、洋川芎內酯I、洋川芎內酯A、粉防己堿、防己諾林堿、青藤堿在24 h內穩定，其穩定性RSD分別為1.64%、1.31%、1.71%、1.23%、1.86%、1.91%、0.97%、0.90%、1.11%，均小于2%，表明樣品在24 h內穩定性良好。

3.7 精密度試驗 同一供試液 (批號101101)，按照上述方法測定，連續進樣6次，測定峰面積。結果供試液中毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、芒柄花素苷、洋川芎內酯I、洋川芎內酯A、粉防己堿、防己諾林堿、青藤堿的RSD分別為0.63%、0.89%、0.91%、1.06%、0.77%、1.21%、1.43%、0.49%、1.33%，均小于 2%，表明精密度良好。

3.8 重復性試驗 同一批號 (批號101101)制劑，研缽研碎，精密稱取6份，每份約1.0 g，按3.1項下方法平行操作制備樣品，進行測定，結果毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、芒柄花素苷、洋川芎內酯I、洋川芎內酯A、粉防己堿、防己諾林堿、青藤堿色譜峰面積RSD分別為1.37%、1.11%、0.89%、0.71%、1.41%、1.62%、0.39%、0.97%、0.81%，均小于2%，表明重復性良好。

3.9 定量限 當信噪比為10時，9種成分進樣量見表5。

表5 9種成分定量限Tab.5 Quantitative limits of nine constituents

3.10 回收率試驗 同一批號 (批號101101)制劑，研缽研碎，精密稱取6份，每份約1.0 g，分別加入對照品溶液適量，按3.1項下方法制備樣品，進行測定，計算回收率，結果制劑中毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、芒柄花素苷、洋川芎內酯I、洋川芎內酯A、粉防己堿、防己諾林堿、青藤堿的加樣回收率分別為99.69%、98.26%、102.94%、98.64%、97.25%、100.21%、98.53%、99.87%、101.32%。

3.11 樣品測定 取芪麝丸樣品 (批號100601、100602、101101)按上述方法測定，并用內標法計算質量分數，測定結果見表6。

表6 芪麝丸中9種成分測定結果Tab.6 Measurement results of nine constituents in Qishe Pill

4 討論

4.1 本實驗測定的芪麝丸中的9種成分涉及3類成分，包括黃酮類、萜類及生物堿，其最大吸收波長青藤堿、毛蕊異黃酮苷、芒柄花素苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素為260 nm，防己諾林堿、粉防己堿、洋川芎內酯I、洋川芎內酯A為280 nm，其各自的最大吸收雖不同，但均在260～280 nm范圍內，經全波長掃描并兼顧9種成分最大吸收波長，確定檢測波長為262 nm，以建立在單波長檢測器的色譜條件。由于黃芪中黃芪甲苷是紫外末端吸收，最大吸收波長是203 nm左右，干擾較大，常采用ELSD檢測器測定，因而本實驗并未考慮采用紫外檢測器對黃芪甲苷進行測定。

4.2 在本制劑色譜圖中出現幾個峰面積較大的未知物，有待進一步確定。

4.3 在固定儀器、固定色譜條件下，要先測定校正因子，再用內標法進行樣品測定，并且每次更換色譜條件后，應對校正因子進行適時驗證，以保證測定結果的準確可靠。

4.4 由于中藥復方藥味較多，其質量控制是一個較為復雜的過程，常采用對君藥或用藥量較多的藥味的主要成分建立定量測定方法進行質量控制，此種傳統質量控制方法較為片面。本實驗采用內標法同時測定了芪麝丸中多種成分，且方法穩定、精密度高、專屬性好，具有較強實用性，為其他品種的中成藥質量控制方法的建立起到了一定的啟示作用。

致謝:洋川芎內酯I對照品由上海中醫藥大學梁爽老師贈送。

［1］張冬青，王德清．黃芪總黃酮生物學活性作用研究進展［J］．中國中藥雜志，2010，35(2):253-256．

［2］謝秀瓊，詹 珂，尹蓉莉，等．川芎揮發油的研究進展［J］．時珍國醫國藥，2007，18(6):1508-1510．

［3］閆 艷，杜晨暉，張淑蓉，等．防己黃芪湯合煎與分煎藥理作用比較研究［J］．山西中醫學院學報，2011，12(1):23-24．

［4］陳 曦，王艷龍．青風藤研究現狀及展望［J］．江西中醫藥，2011，42(2):69-72．

［5］李艷榮，潘海峰．薄層掃描法測定北豆根中青藤堿的含量［J］．承德醫學院學報，2010，27(1):10-12．

［6］劉 冰．用紫外分光光度法和高效液相色譜法測定青藤堿系列產品含量的對比實驗研究［J］．云南中醫中藥雜志，2008，29(10):50．

［7］馬延升，劉志華．旋光法測定鹽酸青藤堿的含量［J］．懷化學院學報，2003，22(5):60-61．

［8］賀云彪，黃蘭芳，胡 偉，等．高效液相色譜測定黃芪中毛蕊異黃酮和芒柄花素的含量［J］．光譜實驗室，2010，27(4):1541-1545．

［9］賀曉艷，宋秋月，鄭 丹，等．HPLC法測定當歸芍藥散中芍藥苷、白芍苷、阿魏酸、洋川芎內酯I的含量［J］．亞太傳統醫藥，2011，7(7):36-39．

［10］魏 素，吳俊賢，黃春曉．HPLC法測定復方羅布麻片中防己諾林堿與粉防己堿的含量［J］．今日藥學，2010，20(7):26-28．

［11］陳 曦．HPLC法青風藤根中青藤堿含量的測定及其提取工藝的優化［J］．安徽農業科學，2010，38(29):16236-16238．

［12］李玉琴，陳興國，齊永秀，等．非水毛細管電泳法測定防己及其制劑中防己諾林堿和粉防己堿的含量［J］．中國中藥雜志，2007，32(19):1992-1995．