UFLC法同時測定參芎葡萄糖注射液中6種主要成分

鄭 林， 龐秀清， 蘭燕宇， 李勇軍， 王永林， 黃 勇*

(1.貴陽醫學院藥學院，貴州貴陽550004;2.貴州省藥物制劑重點實驗室，貴州貴陽550004)

參芎葡萄糖注射液由丹參和鹽酸川芎嗪配伍組成，具有抗血小板聚集，擴張冠狀動脈作用，臨床用于閉塞性腦血管病及其它缺血性血管疾病的治療［1-3］。參芎葡萄糖注射液現行質量標準 (WS-10001-(HD-1136)-2002)的含量測定項目只對丹參素和鹽酸川芎嗪進行定量控制［4］，難以全面反映制劑的化學成分特征。隨著我國藥品生產質量控制水平的提高和對注射劑安全、療效、質量可控等問題重視程度的不斷深入，國家食品藥品監督管理局相繼提出了“國家藥品標準提高行動計劃”和“中藥注射劑安全性再評價工作”［5-7］，以全面提升藥品質量控制水平。本研究基于參芎葡萄糖注射液UPLC-Q-TOF質譜定性分析和組成該注射液復方的藥味丹參的化學成分［8-10］，最終確定了參芎葡萄糖注射液中6種主要化學成分，并建立了UFLC同時測定該6種成分的方法，為參芎葡萄糖注射液的質量控制與綜合評價提供科學的參考依據。

1 儀器與試藥

超快速液相色譜系統 (UFLC，島津，包括二元梯度泵、真空脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器、Lcsolution工作站);AE2401/10萬電子天平 (梅特勒－托利多儀器上海有限公司);超純水機 (四川沃特爾科技發展有限公司)。

乙腈 (德國MERCK公司)為色譜純;水為超純水;其他試劑均為分析純。丹參素鈉 (批號110855200508)，鹽酸川芎嗪 (批號 110817-200305)，原兒茶醛 (批號110810-200705)對照品購于中國藥品生物制品檢定所;迷迭香酸 (批號 MUST-10120901)，丹酚酸 B(批號 MUST-11031401)，丹酚酸A(批號MUST-10012901)對照品購于北京恒元啟天化工技術研究院;參芎葡萄糖注射液 (貴州景峰注射劑有限公司提供)。

2 方法與結果［11-12］

2.1 色譜條件 Diamonsil C18色譜柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相乙腈 (A)-0.05%磷酸(B)，體積流量1 mL/min，梯度洗脫，0～7 min，A 2% ～4%;7～12 min，A 4% ～18%;12～15 min，A 18% ～20%;15～22 min，A 20% ～23%;22～32 min，A 23% ～32%;32～42 min，A 32%～35%;42～50 min，A 35% ～90%。柱溫40℃，檢測波長220 nm，進樣量10 μL。

2.2 混合對照品溶液制備 分別精密稱取丹參素鈉、鹽酸川芎嗪、原兒茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A適量，分別置于6個10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得質量濃度分別為1.056、7.649、1.084、1.020、1.046、1.036 mg/mL的對照品貯備液。分別精密量取上述6種對照品貯備液8、6、2、1.2、1.2、1.2 mL置同一個20 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，得混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液制備 精密量取本品10 mL，加5%葡萄糖溶液稀釋，定容至25 mL，搖勻即可。

2.4 專屬性試驗 分別吸取對照品混合溶液和供試品溶液10 μL，在上述色譜條件下測定，結果6種被測成分分離良好，在供試品溶液色譜中與其他物質色譜峰分離度均大于1.5(見圖1)。同時供試品中被測定化合物色譜圖與對照品色譜圖比較，供試品中被測定的6個化合物的紫外光譜圖與各自對照品的紫外光譜圖一致，且經不同流動相系統考察，6個被測成分的保留時間分別與對照品的保留時間一致，說明該方法具有良好的專屬性。

2.5 線性關系考察 精密吸取混合對照品貯備液0.25、0.5、1、2、4、8 mL分別置于6個 10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，按擬定的色譜條件注入UFLC測定，以峰面積對進樣質量進行線性回歸，得各被測成分的回歸方程、相關系數及線性范圍，見表1。

圖1 對照品 (A)和樣品 (B)的UFLC色譜圖Fig.1 Chromatograms of reference substances(A)and sample(B)

2.6 精密度試驗 取同一供試品溶液，按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，分別進樣測定6次，結果6個被測定成分峰面積平均值的RSD分別為0.45%、0.69%、1.87%、0.61%、1.12%、1.17%，表明儀器的精密度良好。

表1 6個被測成分的線性關系Tab.1 Linear relationships of six components

2.7 重復性試驗 取同一批號樣品6份，按供試品溶液制備方法制備供試品溶液并進行測定，結果6個被測定成分質量濃度的RSD值分別為0.46%、0.40%、1.40%、0.81%、1.71%、2.34%。

2.8 中間精密度試驗 以不同時間，不同實驗人員取與重復性試驗同一批號的供試品6份，對其進行測定，將測定結果與重復性結果進行比較，顯示精密度良好，RSD值分別為 0.55%、1.26%、2.19%、0.22%、0.36%、0.68%。

2.9 供試品溶液穩定性試驗 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、12 h進樣測定，結果6個被測定成分峰面積平均值的RSD分別為0.97%、0.93%、2.60%、0.81%、1.16%、2.17%表明供試品溶液在12 h內穩定。

2.10 回收率試驗 精密量取同一批號的參芎葡萄糖注射液5 mL共6份，分別置25 mL量瓶中，精密加入混合對照品溶液適量，按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，進行測定。計算回收率及RSD，結果見表2。

2.11 樣品測定與結果分析 取不同批次的參芎葡萄糖注射液，每個樣品平行做2份，按2.3項下方法制備供試品溶液，并按上述色譜條件進行6種成分的分析，用當天隨行的對照品溶液進行計算，測得6種成分的質量濃度結果見表3。

3 討論

3.1 用二極管陣列檢測器分別對6種成分進行全波長掃描得知，丹參素、鹽酸川芎嗪、原兒茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A的最大吸收波長分別為220，217，230，220，221，221 nm，為兼顧各組分的檢測信號強度和檢測靈敏度，選擇220 nm作為檢測波長。

表2 回收率測定結果 (n=6)Tab.2 Determination results of recovery tests(n=6)

表3 樣品測定結果 (n=2)Tab.3 Determination results of samples(n=2)

3.2 曾對甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.05%磷酸、乙腈-0.5%乙酸等不同配比流動相系統進行考察，經等度或梯度試驗比較，結果表明，以乙腈-0.05%磷酸為流動相梯度洗脫分離效果較好，所檢測的6個成分色譜峰既能達到基線分離，又縮短了分析時間。

3.3 本實驗首次研究建立了UFLC法同時測定參芎葡萄糖注射液中6種活性成分的方法，方法簡便，結果可靠，通過多指標成分的定量控制，能夠綜合反映制劑的內在質量，可用于參芎葡萄糖注射液的質量控制。

［1］陳興堅，劉建紅．參芎葡萄糖注射液的臨床應用進展［J］．中國實用醫藥，2010，5(13):247-249．

［2］于紅梅．參芎葡萄糖注射液治療腦梗死臨床觀察［J］．中國現代藥物應用，2009，3(8):132-133.

［3］吳曉君，周德甫．參芎葡萄糖注射液抗冠心病心絞痛的臨床療效觀察［J］．現代醫藥衛生，2010，26(9):1344-1345．

［4］衛生部藥品標準．化學藥品地方標準上升國家標準第十二冊［S］．2002．

［5］周福成．關于規范提高中藥標準工作進展與任務要求［J］．中國藥品標準，2005，6(6):3-6．

［6］楊 明，伍振峰，王 芳，等．中成藥再評價方法與策略研究［J］．中國新藥雜志，2010，19(24):2267-2270．

［7］高 寧，羅志琴，謝廣茹，等．參麥注射液上市后安全性再評價研究［J］．醫藥導報，2010，30(7):961-962．

［8］郭增軍，龍麗輝，徐 穎，等．UPLC-ESI-MS分析丹參藥材、脂溶性及水溶性提取物的色譜、質譜行為及相關性［J］．中藥材，2010，33(6):925-928．

［9］趙新鋒，王中秋，趙 欣，等．丹參的HPLC-ESI-MSn分析［J］．中成藥，2005，27(9):1068-1069．

［10］劉 娟，劉 穎．丹參藥理活性成分研究進展［J］．遼寧中醫藥大學學報，2010，12(7):15-17．

［11］王 偉，張 雪，褚文靜，等．高效液相二極管陣列檢測法同時測定丹參粉針劑中4種水溶性成分的含量［J］．中成藥，2011，32(2):266-268．

［12］張慧嫻，杜守穎，陸 洋，等．HPLC同時測定丹參水溶性及脂溶性5種成分的含量［J］．中國實驗方劑學雜志，2010，16(15):34-36．