冠心寧注射液中單糖、寡糖的定量測定研究

2012-01-29 08:25:52黃琴偉唐登峰李櫻紅

中成藥 2012年7期

黃琴偉，唐登峰，李櫻紅，李正，祝明

(浙江省食品藥品檢驗所，杭州浙江310004)

冠心寧注射液具有活血化瘀，通脈養(yǎng)心作用，用于冠心病心絞痛［1］。由于冠心寧注射液由丹參、川芎兩味藥組成，為中藥注射液，所含成分復雜，故其成分分析對保障臨床用藥安全起著至關重要的作用。作者曾對丹參和川芎中的水溶性成分丹參素鈉、原兒茶醛、阿魏酸、迷迭香酸和丹酚酸B等進行定量測定，所測得的量占總固體僅為2%～3%，表明冠心寧注射液中仍有大部分成分為未知成分。查閱冠心寧注射液的質量標準［1］，制法項未添加果糖、葡萄糖、蔗糖等輔料。另根據(jù)文獻報道［2-4］，川芎藥材中含有較多糖類成分，丹參藥材中也含有少量的糖類，故對冠心寧注射液的糖類成分進行分析有助于完善其基礎物質研究，完善冠心寧注射液的質量控制方法。本實驗從臨床用藥安全角度出發(fā)進而提高和完善樣品質量控制，對冠心寧注射液中糖類成分進行分析測定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent1100型系列高效液相色譜儀:包括G1311A四元泵，G1322A脫氣機，G1329A自動進樣器，G1316A柱溫箱，Alltech 2000蒸發(fā)光散射檢測器。

1.2 試藥果糖對照品 (批號:100231-200303)、D-無水葡萄糖對照品 (批號:110833-200904)、蔗糖對照品 (批號:1507-200001)均由中國藥品生物制品檢定所提供，供含量測定用。乙腈為色譜純，水為重蒸水。共收集了6個廠家共71批樣品，樣品信息見表1。

吸取上述對照品貯備液3.0 mL，置10 mL量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻即得，作為線性溶液①。

2 方法與結果

2.1 色譜條件以糖基為填充劑 (Prevail Carbohydrate ES柱4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相為乙腈-水 (79∶21);體積流量1.0 mL/min;ELSD檢測器;漂移管溫度100℃;N2流量2.8 L/min。

2.2 對照品溶液的制備分別稱取果糖對照品、葡萄糖對照品、蔗糖對照品377.50 mg、282.05 mg及408.21 mg，置25 mL量瓶中，加水使溶解并稀釋至刻度，搖勻即得，作為對照品貯備液。

表1 71批冠心寧注射液信息Tab.1 Information of 71 batches of Guanxinning Injection

吸取上述線性溶液①2.0 mL，置5 mL量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻即得，作為線性溶液②。

另分別稱取果糖對照品、葡萄糖對照品、蔗糖對照品249.10 mg、175.75 mg及255.56 mg，置15 mL量瓶中，加蒸餾水使溶解并定容至刻度，搖勻即得，作為對照品溶液③。

吸取對照品溶液③3.0 mL，置10 mL量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，作為對照品溶液④。

2.3 供試品溶液的制備取冠心寧注射液2.0 mL置10 mL量瓶，加水至刻度，搖勻，作為供試品溶液。色譜圖見圖1。

圖1 冠心寧注射液單糖、寡糖測定對照品(A)和樣品 (B)HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances(A)and Guanxinning Injection(B)

2.4 線性關系考察精密吸取一定體積的上述各對照品溶液 (線性溶液①1、2、5、10、15、20、25、30 μL;線性溶液②1、2 μL)分別注入色譜儀，以進樣量 (μg)的對數(shù)值 (lgW)為橫坐標(X)，以峰面積的對數(shù)值 (lgA)為縱坐標 (Y)進行線性回歸，建立3種標準糖的線性回歸方程，分別為:果糖 Y=1.707 1 X+8.707 8，r=0.999 6;葡萄糖 Y=1.762 9 X+7.323 2，r=0.999 7;蔗糖 Y=1.672 3 X+8.253 9，r=0.998 7。結果表明:果糖、葡萄糖、蔗糖分別在1.812 ～45.300 μg、1.354 ～ 101.538 μg、1.959 ～146.956 μg范圍內呈良好的對數(shù)線性關系。

2.5 精密度考察取同一份供試品溶液 (批號:091108)，重復進樣6次，記錄峰面積，果糖、葡萄糖、蔗糖的RSD分別為0.2%、0.3%、0.2%，結果表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗取同一份供試品溶液 (批號:091108)，分別在 0、4、8、12、16、21、26 h時注入色譜儀，記錄果糖、葡萄糖、蔗糖峰面積，考察樣品的穩(wěn)定性，試驗結果果糖、葡萄糖、蔗糖的RSD分別為0.1%、0.2%、0.2%，表明被測溶液在26 h內穩(wěn)定。

2.7 重復性試驗按供試品溶液制備方法，取同一批樣品 (批號091108)共6份，注入液相色譜儀，依法測定。結果表明，冠心寧注射液中果糖、葡萄糖、蔗糖及總糖質量濃度分別為32.584、24.225、35.140 mg/mL及91.949 mg/mL，其RSD分別為0.21%、0.37%、0.18%及0.23%。

2.8 準確度試驗取同一批樣品 (批號091108)各1.0 mL，共9份，每3份為一個水平，分別精密加入對照品溶液③1.0、2.0、3.0 mL，按2.3項下制備供試品溶液并按上述色譜條件進行分析，計算回收率和RSD。結果表明，果糖、葡萄糖、蔗糖及總糖的平均回收率分別為105.9%、105.8%、105.3%及105.6%，RSD分別為3.5%、4.2%、3.5%及3.6%，回收率符合要求，結果見表2。

2.9 樣品測定按供試品溶液制備方法，取71批供試品溶液各5 μL，注入液相色譜儀，依法測定，結果見表3。

3 討論

3.1 糖類物質是含多羥基的醛類或酮類化合物。糖類化合物包括單糖、單糖的聚合物及衍生物。以它們水解的情況分類，凡不能被水解成更小分子的糖為單糖，能水解成少數(shù) (2～10個)單糖分子的為寡糖 (或低聚糖)。由于冠心寧注射液的制備工藝中有二次醇沉過程，藥材中的多糖類成分均被醇沉，故僅對藥材中的單糖寡糖進行分析。

3.2 查閱文獻，目前各種單糖和寡糖的分析方法有薄層色譜法 (TLC)［5-7］、薄層色譜掃描法(TLCS)［7］、氣相色譜法［8-9］、高效毛細管電泳法(HPCE)［10］、聚丙烯酰胺凝膠電泳法 (PAGE)［11］、和高效液相色譜法 (HPLC)［12-13］。本實驗擬采用高效液相色譜法，由于糖類沒有紫外吸收，故用高效液相色譜法測定糖類化合物多采用HPLC-RID、HPLC-ELSD和衍生化，為使方法簡單、可行，本實驗采用ELSD-HPLC法對糖類成分進行分析。

3.3 收集多個單糖、寡糖對照品，采用對照品對照法，通過保留時間比較，確證了色譜圖中3個主要色譜峰，分別為果糖、葡萄糖、蔗糖。

3.4 通過對6個不同企業(yè)抽驗的71批樣品進行果糖、葡萄糖、蔗糖3種糖的測定，分析3種糖質量濃度可知，6個廠家的冠心寧注射液中均含有果糖、葡萄糖和蔗糖，但從數(shù)據(jù)可見F廠家的冠心寧注射液中蔗糖的質量濃度極低，為1.943～5.306 mg/mL，B廠家的冠心寧注射液中的葡萄糖質量濃度相對較低，為6.209～18.897 mg/mL。

表2 冠心寧注射液中單糖、寡糖準確度試驗結果 (n=9)Tab.2 Results of recovery tests of Guanxinning Injection(n=9)

3.5 結合總固體物測定結果進行分析，3種糖總量占總固體比例為38.0%～90.9%，A廠家糖總量占總固體比例為42.0%～74.9%、B廠家糖總量占總固體比例為43.9%～58.8%、C廠家糖總量占總固體比例為38.0%～54.3%、D廠家糖總量占總固體比例為38.0%～90.9%、E廠家糖總量占總固體比例為48.5%～53.5%、F廠家糖總量占總固體比例為50.0%～77.0%。其中A廠家糖總量占總固體比例相對偏高，糖總量占總固體60%以上的占72.7%，C廠家和E廠家糖總量占總固體比例相對偏低。