不同月份肉豆蔻葉片揮發油成分分析

趙祥升， 黃立標， 歐淑玲， 馮錦東

(中國醫學科學院藥用植物研究所海南分所，海南萬寧571533)

肉豆蔻Myristica fragrans Houtt為肉豆蔻科植物，主要分布于印度尼西亞、馬來西亞、西印度群島、巴西等地，我國海南、云南、廣東、臺灣等地也有栽培。肉豆蔻種仁為傳統中藥，性溫，味辛、微苦，具有溫中行氣、澀腸止瀉的功效，用于脾胃虛寒、久瀉不止、脘腹脹痛、食少嘔吐等癥，現代藥理學研究表明有較強的抗菌消炎、鎮痛等功效［1］。氣相色譜-質譜聯用 (GC-MS)技術是植物揮發性成分研究的常用分析手段［2］，前人對肉豆蔻種仁的揮發油成分的GC-MS分析已有報道，主要成分為:單萜、倍半萜和芳香類物質［3-4］。但有關肉豆蔻葉片揮發油成分的分析，特別是其動態的變化鮮有報道，前期的工作中對肉豆蔻葉片中主要成分的動態變化做了研究［5-6］，葉片中含油量、α-蒎烯、β-蒎烯、4-萜烯醇3種成分不同月份相對含有量有一定的變化。

本實驗主要是利用GC-MS聯用技術對不同月份肉豆蔻葉片揮發油成分進行檢測，定性、定量分析主要成分，考察相對含有量隨季節變化的趨勢;同時利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”(2004版)軟件比較不同月份揮發油的相似度，以期對肉豆蔻葉片的藥用價值，開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料 Agilent5973-6890氣質聯用儀;Mili-Q純水儀，中藥粉碎機;無水硫酸鈉，乙醚為分析純;肉豆蔻1986年引種至海南省興隆南藥園，每月分別采雌、雄株葉片適量，由中國醫學科學院藥用植物研究所海南分所陳偉平研究員鑒定為肉豆蔻Myristica fragrans Houtt的葉片，采樣時間見表1。

表1 采樣時間Tab.1 Sampling time

1.2 方法

1.2.1 揮發油的提取與樣品制備 取肉豆蔻葉片，按照2010年版《中國藥典》附錄XD方法提取揮發油，葉片為鮮葉，提取工藝為:純水浸泡2 h，料液比1∶10，提取8 h。揮發油加適量無水硫酸鈉脫水，揮發油為淡黃色，收率為雄株葉片為(0.47±0.3)% (g/g)，雌株葉片為 (0.41±0.2)%(g/g)。取揮發油適量，乙醚為溶劑，過0.45 μm有機濾膜，備用。

1.2.2 質譜條件 HP-5MS毛細管柱 (0.25 mm×30 m，0.25 μm);進樣口溫度240℃，升溫程序為初溫40℃，以5℃/min升溫到280℃;載氣為高純氦氣，流量1 uL/min，進樣量1μL，分流比30∶1，FID檢測器溫度250℃。EI電離源，70 ev，離子源溫度230℃，柱前壓5.10×104Pa，掃描范圍 (m/z):35～550。

1.2.3 數據分析 不同月份葉片揮發油的色譜數據由中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統比較其相似性;分別取1、3、5、7、9、11月份雌、雄株揮發油在上述的GC-MS條件下分析，所得質譜圖經計算機處理和NIST05標準質譜圖庫檢索，確定化合物，按峰面積歸一法計算樣品中各化合物在揮發油中的相對百分數。

2 結果與分析

2.1 不同月份揮發油相似度比較 在上述色譜條件下，連續進樣，記錄色譜圖，結果表明色譜儀的精密度，重復性，系統適用性較好。將不同月份肉豆蔻揮發油的色譜輸數據導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”軟件進行數據處理，12個月份的揮發油中共有25個共有峰 (見圖1)，各個峰的相對含有量以及樣品的相似度見表2。25個共有峰保留時間的RSD均小于0.07%，說明樣品的重現性和穩定性較好，但是通過相對含有量的RSD可知，不同月份的揮發油中各個峰有一定的變化。由表2可知:共有峰14不同月份相對含有量的RSD為106.14%，該成分在7、8月的相對含有量最高，其他月份明顯較低，其他峰在不同月份的相對含有量的變化較小。由相似度分析可知12個樣品的相似度均在0.900以上，說明了樣品的一致性較好。相似度的差異可能是由不同月份揮發油中成分相對含有量的變化引起。

圖1 1月份葉片揮發油的色譜圖Fig.1 Chromatogram of volatile oil in leaves from January

2.2 葉片揮發油成分分析 在上述GC-MS條件下，取單月肉豆蔻雌、雄株葉片的揮發油適量，乙醚溶解進樣，樣品總離子流圖 (見圖2)經質譜掃描后，經計算機數據庫系統檢索確定其揮發油的成分，按照峰面積歸一法計算揮發油中各組分的相對含有量。肉豆蔻雌雄株葉片中揮發油的主要成分為單萜類成分，每個樣品中單萜類物質占該樣品成分總數的46.67%～50.00%之間;其次為倍半萜類成分，相對含有量在34.09%～44.18%之間。此外葉片中還含有芳香類物質、二萜等成分。葉片中相對含有量較高的成分主要是:α-蒎烯 (9.10% ～20.10%)、β-蒎 烯 (5.53% ～19.64%)、4-萜品醇(9.93% ～ 13.58%)、γ-松油烯 (3.32%～7.50%)、肉豆蔻醚 (1.30%～11.24%)、α-水芹烯 (1.16% ～3.31%)、3-蒈烯(0.21%～4.44%)、α-松油醇(2.12%～3.75%)等。Madhavan［7］研究的肉豆蔻葉油中主要成分為:α-蒎烯，檜烯，苧烯等;陳迪華等［8］研究表明葉油中主要成分為 α-蒎烯、β-蒎烯、α-水芹烯、肉豆蔻醚與本結果相似但含有量有差異。Lavanya在對雌雄株的研究中顯示雄株和雌株的GC圖譜沒有區別，雌株葉油中肉豆蔻醚和欖香素的含有量顯著低于雄株葉油，與本實驗的結果相同。此外表-雙環倍半水芹烯、α-紫穗槐烯、β-律草烯、葉綠醇等物質第一次從肉豆蔻葉片中分離得到。

表2 不同月份葉片揮發油中共有峰的相對含有量、相似度Tab.2 Relative contents of common peaks and similarity of volatile oil from leaves in different months

圖2 3月份雌雄株揮發油總離子流圖Fig.2 Total ion currents of volatile oil from leaves of male and female in March

2.3 主要成分數量的變化 根據GC-MS檢測的結果，肉豆蔻1、3、5、7、9、11月份雌雄株葉片揮發油成分相對含有量大于0.1%的物質數量隨月份變化見圖3。有圖可知，主要成分數量的變化在前幾個月的變化不大，但在11月份雌株中成分的數量明顯低于雄株。10、11月是海南肉豆蔻收獲的季節，果仁積累物質的重要時期，物質貯存向果仁轉變，也可能與合成酶的活性有關，因此雌株中含量的物質發生了減少。

圖3 主要成分 (＞0.1%)數量變化Fig.3 Variation of the number of the main components(＞0.1%)

表3 肉豆蔻葉片揮發油中主要成分Tab.3 Main components of volatile oil from leaves of Myristica fragrans Houtt

續表3

續表3

2.4 主要成分含有量變化 肉豆蔻葉片中含有量最高的為α-蒎烯、β-蒎烯、4-萜品醇，但3種成分的動態變化已有報道。在此選擇具有肉豆蔻特征性成分:γ-松油烯、3-蒈烯、α-水芹烯、異丁香酚和肉豆蔻醚，觀察動態變化趨勢。由圖4可知5種成分中變化幅度最大的為肉豆蔻醚，雌株葉片中7月份含有量最高達到10.25%，1月最低僅為1.30%;雄株中3月份含有量最高:11.24%，7月最低:1.68%。其他幾種成分的變化幅度相對較小，異丁香酚和α-水芹烯相對含有量比較穩定。3-蒈烯的變化幅度也較大，雌株1、3月含有量最低0.21%、0.87%;雄株5月含有量最低:0.15%，但值得注意的是在3-蒈烯相對含有量最低的樣品中2-蒈烯的含有量相對較高;說明兩者之間在植物體內有異構體相互轉化的可能性。

圖4 5種成分的變化趨勢Fig.4 Trends of contents of five components

3 討論

肉豆蔻葉片揮發油中萜類成分與前人研究的種仁中的差異不大，肉豆蔻中的活性物質如:肉豆蔻醚、欖香素、丁香酚、異丁香酚和黃樟腦等在葉片中都檢測到，但含有量與前人研究的有差異。王瑩對商品肉豆蔻中揮發油分析中肉豆蔻醚、欖香素、丁香酚的含有量 (最小值)分別為:37.63%、1.77%、0.4%均高于本實驗結果，異丁香酚的含有量差異不大;Muchtaridi等［9］測得肉豆蔻種仁揮發油中這幾種成分的含有量也均高于本實驗結果。肉豆蔻中的這幾個成分既是活性物質也是有毒物質，肉豆蔻醚和欖香素即是抗氧化的有效成分［10］，也是致幻［11］的毒性物質，也有研究表明丁香酚也可能會提高致幻作用［12］，這些成分在食品、調味品中的添加量上也做了明確的限制［13］，因此肉豆蔻資源在開發利用中要慎重。

在前期的研究中發現肉豆蔻雌株揮發油的含有量高于雄株，雌株在4、10月的含油量最高，雄株呈現先升高再降低最后趨于穩定的趨勢。在對雌雄株中含有量大于0.1%成分的數量上的比較中兩者沒有差異，化合物中單萜類，倍半萜成分的比例差異不大，通過樣雌雄株的樣品的GC圖譜的相似度比較可以確定肉豆蔻雌雄株葉片揮發油成分差異不大。但是雌株葉片中肉豆蔻醚和欖香素的含有量顯著低于雄株葉油，而前人在對肉豆蔻種仁揮發油的的GC-MS分析中:肉豆蔻醚和欖香素的含有量都相當的高［5，9］。兩化合物在雌雄株中含有量的差異性的原因還有待進一步研究。

肉豆蔻在海南引種栽培已有研究，在對其氣候適應性分析表明海南有較大面積適宜該物種的栽培［14］。肉豆蔻葉片成分比較研究對其資源的利用，葉片揮發油質量控制，化學成分指紋圖譜的制定提供了科學依據。同時對肉豆蔻規范化種植，資源開發都有重要意義。

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