高效液相色譜法測定不同方法提取非洲馬鈴果中的柳葉水甘草堿

王 榮， 李多偉

(西北大學生命科學學院，陜西西安710069)

非洲馬鈴果Voacanga africana Stapf又名非洲伏康樹、非洲沃坎加樹，是一種產自非洲的夾竹桃科植物。這種植物在新幾內亞、印度尼西亞和菲律賓被記錄過，它被描述為在亞洲很普遍，而且是最容易變異的種類。國外研究發現，非洲馬鈴果的提取物對體外大鼠臂旁核神經元興奮和突觸傳遞具有調節作用［1］，其樹皮提取物對實驗性胃潰瘍大鼠有抗潰瘍效應［2］，對62.5% ～87.5%的小鼠的驚厥及轉向行為紊亂有抑制作用［3］。近年來，對非洲馬鈴果藥用價值的研究認為，非洲馬鈴果提取物可用于治療中風后遺癥、缺血性高血壓腦病等，還有提高記憶力，改善視力，抗衰老等作用。因此，近年來非洲馬鈴果的應用價值受到越來越廣泛的關注。

柳葉水甘草堿 (Tabersonine)又名它波寧，是非洲馬鈴果中的一種單吲哚類生物堿，屬長春花屬生物堿中的白堅木堿型。分離純化的柳葉水甘草堿為油狀液體，弱堿(pKa=5.77)，分子式為C21H24N2O2;貓體試驗結果顯示，柳葉水甘草堿有降血壓的作用，其強度為利血平的25%［4］。柳葉水甘草堿作為重要藥物長春胺的合成前體［5］，具有重要的開發利用價值。長春胺可用于治療慢性缺血性腦血管病、腦梗塞、老年癡呆等癥［6-8］，具有活血降壓、改善視力、抗衰老和抗氧化等作用［9-11］。目前，長春胺雖已可人工全合成，但以柳葉水甘草堿為前體半合成長春胺的思路，啟發了一種長春胺獲得的新途徑。又因柳葉水甘草堿在非洲馬鈴果中的含有量相對較高，可達到2%［12］，且市面上對其需求日益增加，因此可通過從非洲馬鈴果中提取來進行工業生產。本實驗致力于建立一種準確、高效、快捷的柳葉水甘草堿測定方法，以期為柳葉水甘草堿的測定提供科學有效的檢測手段，并對提取條件做優化篩選，為實際生產提供引導。

1 儀器與試藥

島津LC—20A型高效液相色譜系統:包括LC—20AT型高壓恒流泵、SPD—20A檢測器和LC Solution工作站;柳葉水甘草堿對照品 (美國Sigma公司);非洲馬鈴果 (英杰華納生物工程有限公司);乙腈為色譜純，其他試劑均為國產分析純，水為二次蒸餾水，流動相經過0.45 μm微孔濾膜濾過。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Inertsil C18色譜柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相為乙腈-0.1 mol/L碳酸銨溶液 (7∶3，v/v);體積流量1.2 mL/min;檢測波長275 nm;柱溫為室溫;進樣量20 μL。在該色譜條件下，柳葉水甘草堿的保留時間約為15 min，色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 色譜條件優選 本實驗對比了0.7 mL/min，1.0 mL/min和1.2 mL/min 3種體積流量下柳葉水甘草堿的分離效果，結果表明體積流量對柳葉水甘草堿的峰形影響不大，只對保留時間有較大的影響。在0.7 mL/min體積流量下樣品中柳葉水甘草堿出峰時間大約在26 min左右，1.0 mL/min體積流量下保留時間約為18 min，而在1.2 mL/min體積流量下保留時間約為15 min。本實驗選擇體積流量為1.2 mL/min。

2.3 對照品溶液的制備 精密稱取柳葉水甘草堿對照品0.050 0 g，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，制成質量濃度為1 mg/mL的對照品溶液，貯存備用。

2.4 樣品溶液的制備

2.4.1 冷浸提取 準確稱取5.00 g非洲馬鈴果粉末12份，分別浸于50 mL 95%甲醇、95%乙醇、正己烷和石油醚中，每種溶劑3份。冷浸24 h，過濾，濾液分別用各自溶劑定容至50 mL，貯存備用。

2.4.2 熱回流提取 準確稱取5.00 g非洲馬鈴果粉末12份，分別浸于50 mL 95%甲醇、95%乙醇、正己烷和石油醚中，每種溶劑3份。熱回流提取1.5 h，過濾，濾液分別用各自溶劑定容至50 mL，貯存備用。

2.4.3 超聲提取 準確稱取5.00 g非洲馬鈴果粉末12份，分別浸于50 mL 95%甲醇、95%乙醇、正己烷和石油醚中，每種溶劑3份。超聲法提取30 min，過濾，濾液分別用各自溶劑定容至50 mL，貯存備用。

2.5 供試品溶液的制備 精密吸取2.4項中各樣品溶液1 mL，蒸干溶劑，分別加甲醇超聲溶解并轉移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.6 線性關系考察 分別精密吸取2.3項中對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL定容至10 mL。按2.1項中色譜條件測定，以對照品質量濃度為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程:Y=15 749X－1 092，r=0.999 5，線性范圍為0.02～0.2 mg/mL。

2.7 精密度試驗 精密吸取供試品溶液20 μL，按2.1項中色譜條件重復進樣5次，結果峰面積積分值的 RSD為0.75%。

2.8 加樣回收率試驗 精密吸取已測定的樣品溶液2 mL，共5份，分別加入2.3項中的對照品溶液0.5 mL，按2.5項中方法制備成供試品溶液，經0.45 μm微孔濾膜過濾后供HPLC檢測，進行加樣回收率試驗，結果見表1。

2.9 樣品測定 將2.5項中制備的供試品溶液，按2.1項中色譜條件進行測定，結果見表2。

由表2可知，以柳葉水甘草堿含有量為指標，冷浸法中各溶劑提取率大小依次為正己烷＞95%甲醇＞95%乙醇＞石油醚;熱回流法為95%甲醇＞95%乙醇＞正己烷＞石油醚;超聲法為95%甲醇＞95%乙醇＞石油醚＞正己烷。

此外，以HPLC色譜圖中雜質峰出現的多少為指示，可知95%甲醇和95%乙醇提取的樣液中雜質較多，正己烷和石油醚提取的樣液中雜質較少。

表1 柳葉水甘草堿加樣回收實驗結果(n=5)

表2 不同方法提取柳葉水甘草堿的結果比較(n=3)

總之，3種方法中以熱回流法提取柳葉水甘草堿含有量最高，分別達到冷浸法和超聲法的約3.6倍和1.5倍。優選溶劑時，綜合考慮提取量和雜質量的雙重因素，確定最佳提取溶劑為正己烷。

3 討論

目前，柳葉水甘草堿的測定方法國內報道甚少，本研究建立了柳葉水甘草堿測定的高效液相色譜法，并對測定柳葉水甘草堿的色譜條件進行了優化篩選，結果顯示，當流動相體積流量為1.2 mL/min時保留時間最短，約為15 min。

此外，在上述建立的檢測方法下對不同方法提取的非洲馬鈴果中柳葉水甘草堿進行了測定，并對4種溶劑的提取率進行考察，結果顯示，冷浸法中以正己烷提取率最高，熱回流法和超聲法中均以95%甲醇提取率最高，但較正己烷和石油醚而言，95%甲醇和95%乙醇提取的樣液中雜質較多，考慮到后續純化工作的需要，選擇正己烷熱回流法提取非洲馬鈴果中的柳葉水甘草堿。因此，綜合考慮，確定最佳提取方案為正己烷熱回流法。

從非洲馬鈴果中提取柳葉水甘草堿最大的好處就是獲得量高。經測定，本實驗中確定的正己烷熱回流法提取的柳葉水甘草堿質量分數約為0.7%，具備生產的含有量要求，因此可用于實際生產。

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