RP-HPLC法測定月腺大戟 (狼毒)中2種活性成分

袁海建， 程林兵， 蔡寶昌， 李俊松， 陳宜剛

(1.泰州職業技術學院，江蘇泰州225300;2.國家教育部中藥炮制規范化及標準化工程研究中心江蘇省中藥炮制重點實驗室，江蘇南京210029;3.福建農林大學，福建福州350002)

月腺大戟為大戟科Euphorbiaceae大戟屬Euphorbia月腺大戟Euphorbia ebracteolata Hayata．的塊狀根，是中藥狼毒的原植物之一。具有抑菌殺蟲［1-2］作用，民間還用于抗結核［3］和抗腫瘤［4-5］等。近年來的研究［6］表明，其主要有效成分［7］有狼毒乙素、狼毒丙素等化合物。為了更好的控制狼毒藥材的質量，本實驗報道了月腺大戟中狼毒乙素、狼毒丙素兩種有效成分的HPLC的分析方法，在實際樣品的分析中取得了滿意的結果。

1 儀器與試劑

Agilent 1100高效液相色譜儀，包括柱溫箱、在線脫氣機、四元泵及二極管陣列檢測器 (美國 Agilent公司);AG285電子天平 (瑞士METTLER公司);KQ—500E型超聲清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司)。

狼毒乙素對照品、狼毒丙素對照品 (江蘇省中國科學院植物研究所惠贈，純度＞99%);月腺大戟藥材 (分別購自亳州藥材總公司，批號:100606、100822，南京同仁堂藥 業 有 限 公 司， 批 號:2010100060、2010090020、2010090060、2010100010)經南京中醫藥大學藥學院劉訓紅教授鑒定均為月腺大戟Euphorbia ebracteolata Hayata．正品;乙腈 (美國Tedia公司，色譜純)，純凈水 (娃哈哈有限公司)，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜分析條件 Welchrom-C18柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm);柱溫30℃;流動相為乙睛 (A)-水 (B)梯度洗脫，0～11 min，25%A，75%B;11～12min，25% ～45%A，75% ～55%B;12～20min，45% ～70%A，55% ～30%B;20～21 min，70% ～25%A，30% ～75%B。體積流量1.0 mL/min;進樣量20 μL;檢測波長290 nm。按照上述色譜條件進行測定，結果顯示狼毒乙素、狼毒丙素與其他雜質峰得到很好的分離。各成分理論塔板數不低于4 500。見圖1。

圖1 對照品 (A)和藥材 (B)HPLC色譜圖

2.2 供試品溶液的制備 取各樣品粉末 (過三號篩)約2 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加甲醇50 mL，密塞，精密稱定質量，超聲處理 (功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再精密稱質量，用甲醇補足失質量，用微孔濾膜 (0.45 μm)濾過，即得。

2.3 對照品溶液的制備 分別精密稱取狼毒乙素、狼毒丙素3.00、3.90 mg，加甲醇溶解并定容至50 mL量瓶中，搖勻，即得狼毒乙素、狼毒丙素標準貯備液。精密量取狼毒丙素貯備液5 mL，狼毒乙素貯備液5 mL，至10 mL量瓶中，即得對照品溶液。

2.4 線性考察 精密量取對照品溶液0.1、0.4、0.8、1.2、2.4、3.5 mL，分別加甲醇定容至10 mL。分別吸取上述對照品溶液20 μL注入高效液相色譜儀中，記錄峰面積;以進樣量 (μg)為橫坐標，峰面積為縱坐標進行線性回歸，得狼毒乙素的線性范圍為0.000 3～0.21μg，回歸方程為Y=6×106X+4.225 8，r=0.999 9;狼毒丙素的線性范圍為0.003 9～0.273μg，回歸方程為Y=2×106X+10.734，r=0.999 9。

2.5 精密度試驗 取同一混合對照品溶液，分別含狼毒乙素0.010 5 mg/mL、狼毒丙素0.013 65 mg/mL，連續進樣5次，測定峰面積，2種物質在此測定方法下，測得狼毒乙素峰面積的RSD值為0.012%，狼毒丙素峰面積的RSD值為0.037%。

2.6 穩定性試驗 在上述色譜條件下，取同一供試品溶液，分別在保存0、2、4、6、12、24 h進行測定，測定峰面積，2種物質在此測定方法下，測得狼毒乙素峰面積的RSD值為1.11%，狼毒丙素峰面積的RSD值為1.37%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.7 重復性試驗 取同一月腺大戟藥材 (亳州藥材公司-1)粉末 (過三號篩)，按供試品制備方法，平行制備6份，進行測定，計算狼毒乙素、狼毒丙素的的含有量，RSD分別為1.30%、1.54%，表明該測定方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗 精密稱取已測定的月腺大戟藥材(亳州藥材公司-1)粉末 (過三號篩)，共6份，各約1g，精密稱定，分別精密加入狼毒乙素、狼毒丙素對照品，按照供試品溶液制備，測定含有量并計算加樣回收率，結果見表1。

表1 狼毒乙素、狼毒丙素加樣回收率結果(n=6)

2.9 樣品測定 精密稱取不同供應商、不同批次月腺大戟藥材粉末各2.0 g(過三號篩)，按照2.2項供試品制備方法制備，以20 μL進樣，測定色譜峰峰面積，根據標準曲線計算質量分數，結果見表2。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 狼毒乙素和狼毒丙素具有相同的母核，結構上具有一定的相似性。結合文獻報道［8-9］，實驗通過使用DAD檢測器，對被測物質進行了全波長掃描，考察了狼毒乙素、狼毒丙素最大吸收峰情況。結果表明，狼毒乙素的最大吸收峰在293 nm左右，狼毒丙素的最大吸收峰在288 nm左右。綜合考慮，本實驗選擇的檢測波長為290 nm，實際檢測結果顯示，效果較好。

表2 樣品測定結果 (n=3)

3.2 流動相的選擇 狼毒乙素和狼毒丙素具有相同的母核［10］，因母核上取代基的不同造成極性略有差異，實驗經過多次調整梯度洗脫時流動相比例、體積流量、柱溫、最終篩選出使各成分能夠較好分離的色譜條件。

3.3 藥材提取方法考察［11-12］實驗采用單因素法，考察了水、甲醇、1%乙酸-95%乙醇、95%乙醇、70%乙醇、70%甲醇不同提取溶劑對狼毒乙素和狼毒丙素提取效率的影響，結果顯示甲醇提取效率較高;比較了回流、冷浸、超聲3種提取方法，結果表明超聲提取效果較好;比較了超聲提取20、30、40 min的提取效果，結果表明隨著超聲時間的延長，提取效率提高，但是到達一定時間后，其提取效率不再提高，故選擇超聲提取30 min;比較了25、50、75倍提取溶劑對提取效率的影響，結果顯示用50倍量提取液的提取效果較好。

致謝:承江蘇省中國科學院植物研究所張涵慶研究員惠贈對照品并給予指導。

［1］高 櫞，萬賽羅，蔡永萍，等．月腺大戟根總黃酮對尖孢鐮刀菌抑制作用的研究［J］．激光生物學報，2008，17(2):213-219．

［2］孟 娜，周守標，蔣繼宏．月腺大戟(Euphorbia ebracteolata)根部提取物抑菌作用的測定［J］．生物學雜志，2005，22(4):16-18．

［3］趙奎君，徐國鈞，金蓉鸞，等．狼毒類中藥對結核桿菌抗菌作用的比較［J］．中國藥科大學學報，1995，26(2):122．

［4］王文祥，丁杏苞．月腺大戟的化學成分研究［J］．中草藥，1999，30(1):1-3．

［5］杜 娟，徐瑞軍，崔 晞，等．月腺大戟水提物誘導P388白血病細胞的凋亡［J］．中國醫院藥學雜志，2007，27(4):454-458．

［6］張涵慶，丁云梅，陳桂英，等．月腺大戟根中有效成分的研究［J］．植物學報，1987，29(4):429-431

［7］顏秉強，張永清．月腺大戟研究進展［J］．山東中醫藥大學學報，2008，32(5):432-435．

［8］謝演暉，嚴小紅，王燦堅，等．RP-HPLC法測定月腺大戟中狼毒乙素的含量［J］．中藥材，2010，33(4):568-570．

［9］趙奎君，徐國鈞，金蓉鸞，等．HPLC法測定月腺大戟根中狼毒甲素及狼毒乙素的含量［J］．中草藥，1995，26(2):66-67．

［10］張涵慶．月腺大戟根中有效成分乙素和丙素的結構研究［J］．植物資源與環境，1992，1(3):6．

［11］袁海建，賈曉斌，陳 彥，等．正交試驗優選龍葵的提取工藝［J］．中成藥，2009，31(1):120-122．

［12］袁海建，賈曉斌，陳 彥，等．不同產地龍葵藥材中澳洲茄堿量的分析研究［J］．中草藥，2008，39(5):772-774．