HPLC法測定猴頭菌片中腺苷

顧慧芬， 莊意麗， 張夢玲

(上海市中藥研究所，上海201401)

猴頭菌片是采用與猴頭菌Hericium erinaceus(Bull．)Pers．有效成分相一致的猴頭菌菌絲體提取物制成的制劑。具有益氣補血、扶正培本、養胃護胃的作用，臨床上常用于治療胃潰瘍、十二指腸潰瘍及慢性胃炎等，對多種消化道疾病均有較好的療效［1］。

猴頭菌片含多糖、多肽類、氨基酸等物質，具有免疫調節，保護胃腸道等作用。猴頭菌絲體中含有較高含有量的腺苷［2-3］。腺苷具有廣闊的生理活性，包括鎮靜、擴血管、抗缺氧［4］及較弱的抗炎、降膽固醇等作用。現用標準主要是以多糖為質量標準，在猴頭菌片生產過程中由于輔料的加入干擾多糖含有量的準確性，所以研究腺苷含有量指標［5-6］作為一個復合的分析指標具有較大意義。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent-1100高效液相色譜儀系統，Millipore Milli-Q超純水制備儀，CQ—6超聲波清洗器 (上海滬超超聲波儀器有限公司)。

1.2 試藥 甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純;腺苷對照品 (中國藥品生物制品檢定所110879-200202);猴頭菌片 (由上海雷允上藥業有限公司提供，規格:0.26 g/片，批 號:08050102， 08080101， 08120101， 09030701，09070302，09100102，10040802，10050302，10030501)。

2 方法與結果

2.1 HPLC色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱:(5 μm，4.6 mm×250 mm);流動相為甲醇-0.01%乙酸(9∶91);檢測波長為260 nm;體積流量1.0 mL/min;柱溫25℃;進樣量10 μL。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取恒質量的腺苷對照品適量，置25 mL量瓶中，加15%甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成質量濃度為0.016 mg/mL的腺苷對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱取樣品約0.5 g，研細，置具塞錐形瓶中，精密加入15%甲醇25 mL，稱定質量，超聲提取30 min，放冷，稱定質量，用15%甲醇補足減失的質量，3 000 r/min離心5 min，過濾，取續濾液，用微孔濾膜 (0.45 μm)濾過，即得。

2.4 陰性空白樣品溶液的制備 稱取不含猴頭菌菌絲體的陰性空白樣品溶液，按照供試品溶液的制備方法制成陰性空白樣品溶液。

2.5 系統適用性試驗 取腺苷對照品溶液、供試品溶液和陰性空白溶液各10 μL測繪HPLC圖譜。結果在對照品溶液和供試品溶液色譜圖相應位置上，有相同保留時間的色譜峰，而陰性空白樣品在腺苷出峰時間區域沒有干擾峰出現，故對腺苷的測定無干擾作用。見圖1。

2.6 線性關系的考察 將質量濃度為0.003 2 mg/mL的腺苷標準品溶液，HPLC分別進樣2、5、8、10、15、30 μL，以腺苷標準品進樣量為橫坐標 (x)，以測定的腺苷峰面積積分值為縱坐標 (y)，繪制標準曲線。得回歸方程:y=10.3x－1.24，r=0.999。結果表明腺苷在0.006 4～0.096 μg范圍內呈現出良好的線性關系。

2.7 精密度試驗 精密吸取腺苷對照品10 μL，按2.1項色譜條件，重復進樣6次，測定腺苷峰面積，RSD值為1.7%。說明儀器性能良好，符合定量分析的要求。

2.8 穩定性試驗 取同一批號供試樣品1份，按2.3項供試品溶液的制備方法，制備成供試液，在常溫下放置24 h，于0、2、4、6、8、10、24 h分別進樣10 μL，測得的峰面積RSD為1.2%，結果表明樣品溶液中的腺苷，在24 h內穩定性良好。

2.9 重復性試驗 取同一批號樣品6份，按2.3項供試品溶液的制備方法，制備成供試液，平行測定6次，結果測得峰面積RSD為0.85%(n=6)，說明方法重復性良好。

2.10 加樣回收率試驗 取已知含有量的供試樣品9份，分別加入一定量的腺苷對照品，按2.3項供試品溶液的制備方法，在腺苷的線性范圍內分別制成低、中、高3種不同質量濃度的溶液 (每一種質量濃度3份)。分別進樣，測定峰面積及標準偏差。結果見表1。

圖1 對照品溶液 (A)、供試品溶液(B)和陰性樣品溶液 (C)HPLC色譜圖

表1 回收率測定結果

2.11 樣品的測定 精密稱取9批猴頭菌片0.5 g，按2.3項供試品溶液的制備方法，制備成供試品溶液。以質量濃度為0.016 mg/mL的腺苷為對照品溶液，按2.1項下色譜條件進樣10 μL，測定腺苷峰面積，計算質量分數。結果見表2。

表2 樣品測定結果

3 討論

猴頭菌片是由固體培養菌絲體經熱水浸提，濃縮而制成的片劑。其藥效是各組成成分復雜的綜合作用，含有多糖、氨基酸等物質，還含有較高含有量的腺苷。本實驗研究表明，猴頭菌片中含有相當含有量的腺苷。現有文獻報道HPLC法測定腺苷方法很多［7-12］，但用于本制劑測定，分離效果不理想。由于腺苷為水溶性物質，且較穩定的特性，本實驗采用適當的提取分離方法，用高效液相色譜法測定猴頭菌片中腺苷結果較滿意。測定結果表明，在9批猴頭菌片中，腺苷質量分數為0.148 0～0.209 2 mg/g。本研究方法簡便、快速，測定結果準確可靠，且不同批次之間腺苷含量較穩定，可用于猴頭菌片的質量控制。

猴頭菌片現用標準主要是以多糖為質量標準，在生產過程中由于輔料的加入干擾多糖含有量的準確性，研究猴頭菌片腺苷含有量指標與多糖一起成為產品復合式的質量分析指標，對提高產品質量指標及產品質量穩定性具有較大意義，為猴頭菌片質量的提高及標準的完善提供依據。

［1］周靜安．RP-HPLC測定復方猴頭顆粒劑中腺苷的含量［J］．中成藥，2005，27(2):213-214．

［2］李潔莉，陸 玲，陳 坤，等．猴頭菌及其藥物制品腺苷等藥效成分分析［J］．中國食用菌，2002，21(3):32-34．

［3］戚雁飛．HPLC測定復方猴頭膠囊中腺苷的含量［J］．中成藥，2002，24(3):181-183．

［4］王二麗，何榮和．HPLC法測定中藥靈芝中腺苷的含量［J］．海峽藥學，2009，21(3):46-47．

［5］李祥玲，胡勁松，陳作紅．HPLC測定人工蛹蟲草及其培養基中蟲草素和腺苷含量［J］．湖南師范大學自然科學學報，2010，33(2):107-111．

［6］原 忠，董 焱，朱靜娟．HPLC測定北沙參中腺苷的含量［J］．中國中藥雜志，2005，30(7):1391-1392．

［7］顏棟林．HPLC法測定冬蟲夏草膠囊中腺苷含量［J］．藥學實踐雜志，2010，28(4):293-295．

［8］陳在敏．HPLC法測定珍珠靈芝膠囊中腺苷的含量［J］．海峽藥學，2008，20(1):46-48．

［9］范志華，湯衛華，林 霖．HPLC法測定冬蟲夏草發酵菌絲粉中腺苷的含量［J］．現代食品科技，2007，23(7):94-97．

［10］李躍輝，楊永華，張水寒，等．高效液相色譜法測定冬蟲夏草超微飲片中腺苷含量［J］．中國醫院藥學雜志，2005，25(10):985-985．

［11］張朔生，馬雙成．高效液相色譜法測定至靈膠囊中腺苷的含量［J］．中國藥事，2005，19(5):298-299．

［12］俞青芬．HPLC法測定冬蟲夏草菌粉及含片中腺苷的含量［J］．廣西師范大學學報:自然科學版，2010，28(2):65-68．