激肽釋放酶相關肽6對乳腺癌細胞遷移侵襲的影響及其組織表達意義

黃福生，黎漢忠，劉志輝，王洪學，李永強※

(1.扶綏縣人民醫院普外科，廣西扶綏532100;2.廣西醫科大學附屬腫瘤醫院化療一科，南寧530021)

乳腺癌為常見的人類惡性腫瘤。在西方發達國家，乳腺癌為最常見的女性惡性腫瘤［1］。傳統觀點認為我國屬于乳腺癌相對低發地區，然而近年來我國乳腺癌發病率呈上升趨勢［2］，這種態勢在生活水平高的地區尤為明顯。據統計，乳腺癌發病率已居我國女性惡性腫瘤的第2位，在沿海經濟發達地區已經成為發病率居首的女性惡性腫瘤。手術切除是治療乳腺癌的基本手段，但部分具有遠處侵襲傾向，惡性程度高的乳腺癌患者出現術后復發，并且往往對術后放化療相對不敏感，而遠處轉移是這部分患者死亡的主要原因。因此，尋找可早期判斷轉移傾向的分子標志物，乃至探索預防轉移的有效干預點顯得尤為迫切。眾多研究已經表明腫瘤細胞從靜息狀態到轉移侵襲的激活，其所處的局部微環境發揮了決定性的作用。腫瘤間質是腫瘤微環境的重要組成部分，腫瘤間質分泌的各種蛋白酶調節著腫瘤細胞的功能狀態。本課題研究了激肽釋放酶相關肽6 (kallikrein-related peptidase 6，KLK6)對人乳腺癌細胞株MDA-MB-231遷移及侵襲運動的影響及其高表達的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞培養液及其試劑 細胞培養采用的胎牛血清為杭州四季青公司產品; DMEM培養基，D-Hanks緩沖液為美國Introvigen公司產品;胰蛋白酶為美國Amresco公司產品。細胞培養液由10%胎牛血清加入DMEM培養基中制備而成，每升培養液含青霉素1×105U及鏈霉素0.1 g。將胰蛋白酶(終濃度0.25%)溶于D-Hanks液后過濾除菌后用于細胞消化傳代。人激肽釋放KLK6重組蛋白購于美國My-BioSource公司，溶于二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)中后4℃保存備用。

1.1.2 實驗用細胞株及乳腺癌組織收集 人乳腺癌細胞株MDA-MB-231購自中南大學湘雅中心實驗室。細胞常規置于37℃含5%的CO2的細胞培養箱中。收集2009年11月至2010年12月在廣西醫科大學附屬腫瘤醫院或廣西壯族自治區扶綏縣人民醫院手術切除的29例乳腺癌組織標本，所有樣本均由病理診斷證實，且均為第1次手術治療，未經放化療等其他治療。所收集組織標本取得患者知情同意。

1.1.3 Transwell實驗用培養板及細胞外基質 12孔嵌入式細胞培養板(直徑10.5 mm，孔徑8 μm)為美國BD Biosciences公司產品。該培養板分為嵌入式的上小室與底部的下室，上小室與下室之間由聚對苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate，PET)膜相隔，8 μm的孔徑可容細胞通過。細胞外基質購于美國BD Biosciences公司，用于實驗前預處理并覆蓋PET膜。

1.1.4 反轉錄-聚合酶鏈反應試劑 TRIzol與反轉錄試劑盒分別購于美國Invitrogen及Promeag公司，TaKaRa Ex Taq耐熱性DNA聚合酶為上海生工生物工程公司產品，引物委托上海生工生物工程公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 劃痕試驗 細胞接種于35 mm培養皿，培養至細胞相互融合鋪滿整個培養皿后，用無菌普通槍頭在培養皿均勻劃痕。無菌PBS緩沖液沖洗3次，換入新鮮培養液，處理組含40 nmol/L人KLK6重組蛋白，該濃度參考以往文獻［3］，對照組加入等量DMSO。拍照并觀察細胞于劃痕處的遷移情況，12 h及24 h后重新于同一視野重新拍照，運用 Quantitative Wound Healing Image Analysis(德國Ibidi公司)在線分析軟件，以細胞覆蓋劃痕處的百分率定量評價細胞的遷移能力。隨機選取6處視野，通過比較兩組間均數評價其統計學意義。

1.2.2 Transwell細胞侵襲實驗 105的MDA-MB-231細胞重懸于10-3/L的無血清DMEM培養液中并接種于上小室，下室放置含10%血清的DMEM培養液。處理組上小室及下室含40 nmol/L人KLK6重組蛋白，處理組加入等量DMSO作為對照，每組6復孔。24 h后移去上小室，4%甲醛用于固定進入下室的細胞，結晶紫染色液染色，Quantity One軟件(美國Bio-Rad公司)測量細胞數，計算24 h后通過PET膜進入下室的細胞數，定量分析處理組與對照組的細胞侵襲能力。

1.2.3 半定量反轉錄-聚合酶鏈反應 按Trizol試劑盒說明提取29例乳腺癌手術切除標本的總RNA，按反轉錄試劑盒說明合成cDNA。寡聚核苷酸引物: (KLK6，正義鏈，5'-GAAGCATAACCTTCGGCAAA-3';反義鏈，5'-GGGAAATCACCATCTGCTGT-3')，內參照磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH，正義鏈，5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3';反義鏈，5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3')。聚合酶鏈反應擴增反應條件:預變性94℃ 5 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，28個循環，72℃延伸4 min (聚合酶鏈反應儀為美國Thermo公司產品)。反應結束后，取聚合酶鏈反應產物各5 μL，2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠電泳成像分析系統掃描。ImageJ軟件取得各樣本電泳條帶灰度值，利用各樣本KLK6/ GAPDH的比值半定量評估KLK6在各樣本中的表達高低。

1.3 統計學方法 采用SPSS 13.0軟件進行統計學分析，兩獨立樣本均數t檢驗用于檢驗組間差異，Fisher確切概率法用于檢驗KLK6高表達與臨床特征的關系，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 KLK6對MDA-MB-231細胞遷移活動的影響細胞劃痕試驗顯示在處理12 h后，處理組的細胞覆蓋面積為59.3%，而對照組為52.2%，處理組細胞覆蓋面積大于對照組，但并無統計學意義;在處理24 h后再次觀察，處理組的細胞覆蓋面積為84.4%，而對照組為64.7%(圖1)，表明人激肽釋放KLK6重組蛋白明顯促進了MDA-MB-231細胞的遷移活動。

2.2 KLK6對MDA-MB-231細胞侵襲能力的影響人KLK6重組蛋白同時加入處理組上小室與下室，對照組加入等量不含重組蛋白的DMSO。24 h后細胞計數顯示，處理組進入下室的細胞數平均為(589± 25)個，而對照組為(474±37)個(圖2)，處理組明顯多于對照組，具有統計學意義(t=6.3083，P＜0.05)，顯示激肽釋放KLK6增強MDA-MB-231細胞侵襲能力。

2.3 KLK6高表達與臨床特征的關系 半定量反轉錄-聚合酶鏈反應結果顯示KLK6在29例乳腺癌原發灶組織中的灰度比值最大值為0.75，最小值為0.25，中位數為0.45，均數為0.44。以≥0.5定義為高表達，分析KLK6與諸臨床特征的關系。所有臨床分期均根據美國癌癥聯合委員會于2003年頒布的乳腺癌TNM分期(第6版)。統計學分析顯示，KLK6高表達與年齡、T分期、M分期無關，與N分期，即淋巴轉移有關(表1)。

表1 KLK6高表達與臨床特征的關系 ［例(%)］

3 討論

KLK6屬于激肽釋放酶相關肽家族成員，該家族作為分泌糜蛋白酶和胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶代表，在各種生理及病理條件下表達，包括各種人類腫瘤［4-6］。以往研究表明通過轉染技術使KLK6在小鼠角質細胞株中異位表達，可破壞細胞間的黏附，加速細胞增殖并增強其遷移、侵襲能力［7］。由于乳腺癌的預后與是否發生淋巴結及遠處轉移密切相關，本課題研究了人重組KLK6蛋白在體外對乳腺癌細胞株MDA-MB-231遷移及侵襲能力的影響，并研究了其在原發腫瘤中高表達的臨床意義。

劃痕試驗是經典的評估體外細胞遷移能力的方法，操作簡便，而本研究進一步通過計算12 h和24 h遷移細胞覆蓋劃痕處的百分率來定量評價其遷移活動，比傳統僅僅通過肉眼觀察更為客觀可信。本研究還運用Transwell細胞侵襲實驗來驗證KLK6在體外對MDA-MB-231細胞侵襲能力的增強。Transwell實驗是近年來發展起來的可用于評估細胞侵襲能力的實驗模型，由于在放置細胞的上小室并沒有血清，具有侵襲傾向的MDA-MB-231細胞會向含有血清營養成分的下室運動，與普通的遷移實驗不同的是，分隔上下小室的PET膜預先包被了細胞外基質，以模仿體內細胞外基質，細胞若進入下室，則先要分泌基質金屬蛋白酶將基質膠降解，方可通過PET膜，這與腫瘤細胞在體侵襲過程是一致的。結果顯示，KLK6不僅明顯促進了MDA-MB-231細胞的遷移，而且增加了MDA-MB-231細胞的侵襲能力。體外實驗提示KLK6表達可能與乳腺癌的轉移有關，為此進一步研究了KLK6在乳腺癌組織的表達與臨床特征的關系。統計學分析顯示，KLK6高表達組的病例其淋巴轉移率明顯高于低表達組，提示KLK6高表達與乳腺癌的轉移傾向密切相關。Breitenbach等［8］報道了在化學藥物誘導的小鼠皮膚癌中，KLK6的高表達出現在進展期的腫瘤組織中，而在 Klucky等［7］的報道中，KLK6的異常高表達也與人類皮膚癌的臨床進展有關。這些研究的結論與本研究的結果相一致，提示KLK6可能是一個通過增加乳腺癌細胞遷移、侵襲能力而促進乳腺癌發展的腫瘤相關蛋白。一項新近的報道初步探討了KLK6作用于腫瘤微環境的具體通路及機制［3］，而通過將來更為深入的研究，KLK6不僅可能成為一個具有臨床診斷意義的蛋白分子，也有望成為一個潛在的乳腺癌治療的基因靶點。

［1］ Jemal A，Siegel R，Xu J，et al.Cancer statistics，2010［J］.CA Cancer J Clin，2010，60(5):277-300.

［2］ 吳寧.乳腺癌的影像診斷:流行病學變化帶來的挑戰以及目前的形勢與任務［J］.中華放射學雜志，2006，40(4):341-343.

［3］ Krenzer S，Peterziel H，Mauch C，et al.Expression and function of the kallikrein-related peptidase 6 in the human melanoma microenvironment［J］.J Invest Dermatol，2011，131(11):2281-2288.

［4］ Borgo?o CA，Diamandis EP.The emerging roles of human tissue kallikreins in cancer［J］.Nat Rev Cancer，2004，4(11):876-890.

［5］ Obiezu CV，Diamandis EP.Human tissue kallikrein gene family:applications in cancer［J］.Cancer Lett，2005，224(1):1-22.

［6］ Yousef GM，Diamandis EP.The new human tissue kallikrein gene family:structure，function，and association to disease［J］.Endocr Rev，2001，22(2):184-204.

［7］ Klucky B，Mueller R，Vogt I，et al.Kallikrein 6 induces E-cadherin shedding and promotes cell proliferation，migration，and invasion［J］.Cancer Res，2007，67(17):8198-8206.

［8］ Breitenbach U，Tuckermann JP，Gebhardt C，et al.Keratinocyte-specific onset of serine protease BSSP expression in experimental carcinogenesis［J］.J Invest Dermatol，2001，117(3):634-640.