孕期染毒PFOS對雄性胎鼠生殖系統的影響

李 欣，金秀東，初彥輝，趙冰海，李 麗，張際緋

(牡丹江醫學院1醫藥研究中心，2生理教研室，3組胚教研室，黑龍江牡丹江157011)

在西方發達國家，男性生殖障礙發病率逐年上升，已成為一個受重視的問題。男性兒童生殖系統的畸變包括尿道下裂和隱睪，青春期發育的紊亂和成年生殖系統的腫瘤以及精子發生障礙統稱為睪丸紊亂綜合征。已有一些動物實驗和流行病學研究表明這些疾病與胎兒期母體及胎兒暴露于環境內分泌干擾因素有關。全氟有機化合物作為一種人造材料具有持久性、高度生物累積性、毒性及可以遠距離環境遷移的特點，符合斯德哥爾摩公約關于持久性有機污染物定義特征，因而引起了更加廣泛的關注，全球限用全氟辛烷磺酸鹽(perfluorooctane sulfonate，PFOS)及其衍生物的呼聲越來越高。胚胎期Leydig細胞只出現在胚胎期睪丸中，因此認為其分化受染色體組分或睪丸特殊機制調控。本研究利用出生前PFOS暴露的染毒方式，監子代一般毒性和睪丸內 Cyp17α1 mRNA表達水平以探討PFOS致生殖毒性的可能機制，為PFOS安全性評價提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 動物為清潔級成年SD大鼠，體質量250～300 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。大鼠飼養于其底裝鋪墊料的多聚碳酸塑料籠具，每籠飼喂1只，連接于獨立供氣動物籠系統，溫度控制在20～25℃，相對濕度40%～60%。照明為普通日光燈，12 h明亮，12 h黑暗。上述動物按隨機數字法分為4組:0.05%TW-20(對照組)、5 mg/(kg·d)(低劑量灌胃組)、、10 mg/(kg·d)(中劑量灌胃組)、20 mg/(kg·d)(高劑量灌胃組)，各4只。

1.2 方法

1.2.1 材料與試劑 試劑PFOS購于sigma公司，RNA提取試劑盒(OMEGA，USA，SYBR(TAKARA，大連)引物設計參照GenBank中序列由上海Invitrogen公司合成，18Srna為內參序列。

1.2.2 動物染毒 SD孕鼠，從孕第11天至孕第19天，每天對給藥動物組腹腔注射染毒PFOS。胎鼠睪丸于母鼠懷孕第20天處死孕鼠，取出胎鼠，記錄胎鼠個數，并稱量胎鼠個體的質量。立體顯微鏡下解剖胎鼠，辨明其雌、雄，觀察睪丸位置和睪丸引帶發育情況。同一胎鼠的2只睪丸分別用于提取 RNA和蛋白質，均保存于液氮備用。

1.2.3 real-time聚合酶鏈反應檢測mRNA 取一側胎鼠睪丸提取RNA，操作按RNA提取試劑盒說明要求進行，經紫外分光光度計測定 D260/D280比值均＞1.8，可用于后續反轉錄-聚合酶鏈反應實驗。樣本設兩個復孔，取其CT均值，根據標準曲線算出目的基因相對表達量。聚合酶鏈反應引物序列見表1。

1.3 統計學方法 采用SPSS 18.0軟件進行統計分析，計量資料用均數±標準差)表示，多組比較采用方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

表1 real-time PCR所用引物

2 結果

2.1 四組孕鼠平均胎鼠個數、雌雄比例、雄胎鼠體重和睪丸質量的比較 四組孕鼠平均胎鼠數、雄性胎鼠體質量、睪丸重量比較差異有統計學意義(P＜0.05);與對照組比較，低劑量組孕鼠平均胎鼠數增多(P＜0.05)，低劑量組和高劑量組雄性胎鼠體質量均明顯降低，中劑量組升高(P＜0.01)，高劑量組睪丸重量下降(P＜0.05)(表2)。

表2 四組孕鼠平均胎鼠個數、雌雄比例、雄胎鼠體重和睪丸質量比較

2.2 睪丸內Cyp17α1 mRNA表達水平的變化 各給藥組與對照組比較，睪丸組織中Cyp17α1的表達量明顯下降(P＜0.01)(圖1)。

圖1 睪丸內Cyp17α1 mRNA表達水平的變化

3 討論

長期以來，人們通常把化學物質對胚胎或胎兒的潛在毒性效應視為研究生殖毒理學的重點。近年來很多研究表明，化學物質對生殖的損害都表現在對性腺的損害。因此，以性腺為研究對象可以更直接的表現化學物質對生殖系統的毒性，發掘睪丸紊亂綜合征的原因。Leydig細胞是一類位于哺乳動物睪丸曲細精管間的間質細胞，它在睪丸發育、精子發生、雄性表型及生精管道的發育中行使重要的功能。Leydig細胞可分為胎兒型及成年型。胎兒型Leydig的主要功能是產生雄激素，維持機體男性化［1］。

研究發現嚙齒類動物胚胎發生期的胚胎Leydig細胞在妊娠第12天出現，出生前1～2 d其合成能力達到最強，出生后很快消失［2］。本研究選擇暴露期從母鼠受孕第12天起，至第19天結束灌胃的方式染毒。結果顯示，與對照組比較，低劑量組孕期暴露于PFOS的孕鼠平均妊娠胎鼠數數量增多(P＜0.05)，其原因是懷孕中期給藥，孕鼠暴露于PFOS時胚胎數和性別基因已經確定，因此無法說明PFOS對胚胎發育的個數和性別確實有影響，此參數只作為參考。與對照組比較，低劑量組和高劑量組雄性胎鼠體質量均明顯降低(P＜0.05)，而中劑量組則升高(P＜0.01)，說明PFOS對胚胎發育有影響。

睪酮是外源性化學物質影響雄性生殖系統的靶標之一。它主要由Leydig分泌，能刺激雄性生殖器官的成熟和發育、促進蛋白質合成、促進精子發生，并且通過負反饋調節機制使雄激素的分泌相對穩定，從而維持機體的正常生理功能。它的生成需要一些酶的參與，如細胞色素 P450膽固醇側鏈裂解酶、β-羥-類固醇脫氫酶、17α羥化酶(P450c17)、17β羥類固醇脫氫酶，其中只有 P450c17相對的基因Cyp17α1與對照組相比表達降低，差異有統計學意義(P＜0.01)。Cyp17α1基因全長大約6 kb，含有8個外顯子，在人體的染色體中定位于10q24.3，編碼508個氨基酸，是單拷貝基因［3］。P450c17在嚙齒類動物的性腺和胎盤中表達而不是在腎上腺，雄性則主要在睪丸中表達［4］。

有實驗表明，雌性大鼠孕期攝入環境雌激素可減少雄性胎鼠睪丸間質中合成睪酮所必需的P45017α-羥化酶/C17，20裂解酶的表達，從而減少睪酮的合成量，影響胎鼠的雄性化過程［5］。P450c17是睪酮生成的關鍵酶，而且在早期胚胎發育的調節中發揮重要作用。有人在正常小鼠胚胎內胚層發現了P450c17酶的活性，刪除鼠標P450c17基因可導致早期胚胎死亡［6］。在本實驗中，與對照組比較，各給藥組Cyp17α1基因表達均降低，表明PFOS對Cyp17α1有抑制作用。P450c17是 Cyp17α1基因的產物，P450c17是把孕酮轉變成雄烯二酮的關鍵酶，Cyp17α1表達減少可導致睪酮生成減少。綜上所述，PFOS具有發育和生殖毒性，孕期接觸PFOS可引起胚胎發育和雄性生殖系統的異常。

［1］ O'Shaughnessy PJ，Baker PJ，Johnston H.The foetal Leydig cell differentiation，function and regulation［J］.Int J Andro，2006，29(1): 90-95.

［2］ Habert R，Brignaschi P.Developmental changes in in vitro testosterone production by dispersed Leydig cells during fetal life in rats［J］.Arch Androl，1991，27(2):65-71.

［3］ Brock BJ，Waterman MR.Biochemical differences between rat and human cytochrome P450c17 support the different steroidogenic needs of these two species［J］.Biochemistry，1999，38(5):1598-606.

［4］ Shi Y，Schonemann MD，Mellon SH.Regulation of P450c17 expression in the early embryo depends on GATA factors［J］.Endocrinology，2009，150(2):946-956.

［5］ Colbron T，Vom Saal FS，Soto AM，et al.Developmental effects of endocrinedi-rupting chemicals in wildlife and humans［J］.Environ Health Perspect，1993，101(5):378-338.

［6］ Bair SR，Mellon SH.Deletion of the mouse P450c17 gene causes early embryonic lethality［J］.Mol Cell Biol，2004，24(12):5383-5390.