米諾環素對腦缺血/再灌注大鼠腦梗死體積及谷氨酸水平的影響

趙 穎，趙連東

(徐州醫學院附屬淮安醫院神經內科，江蘇淮安223002)

在缺血性腦血管病的治療中重建血流或增強缺血區的血流供應是缺血腦組織修復損傷的必需條件，同時帶來的再灌注損傷也是目前最受關注的問題［1］。腦缺血/再灌注引起的神經元死亡的一個重要機制是通過興奮性氨基酸釋放增加所致的興奮毒性發揮作用。谷氨酸是在腦內含量最高的氨基酸［2］。米諾環素(minocycline，MC)是第二代半合成四環素類抗生素，除了具有傳統抗菌作用外，近年來大量研究發現MC還可通過抗炎和抗細胞凋亡機制保護神經元損傷，對各種因素導致的神經細胞損害具有一定的保護作用［3］。研究證實MC能對抗N-甲基-天冬氨酸誘導的興奮毒性，對缺血后谷氨酸水平影響的研究未見報道。本實驗采用大鼠局灶性腦缺血/再灌注模型，觀察大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷后早期應用MC對腦梗死面積及谷氨酸水平的影響，探討MC的神經保護機制，為MC應用于缺血性腦卒中提供基礎實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠 144只，體質量(250±30)g(徐州醫學院實驗動物中心提供)。按隨機分組原則分為4組:假手術組、缺血/再灌注組、MC高劑量組和MC低劑量組，各36只。其中MC高劑量組和MC低劑量組的大鼠先行右側大腦中動脈缺血2 h，而后恢復再灌注，并于恢復再灌注即刻分別腹腔注射MC(45 mg/kg)，隨后每12 h給藥一次(低劑量組22.5 mg/kg、高劑量組45 mg/kg)。組內按隨機數字表法選擇6只用于腦梗死體積測定，各組剩余30只大鼠按再灌注不同時點(2、6、12、24、48 h)隨機分為5個亞組，每亞組6只，用于谷氨酸濃度檢測。

1.2 試劑與儀器 鄰苯二甲醛、谷氨酸標準品購自美國Sigma公司，其他試劑均為國產分析純;Image master圖像分析儀(美國Pharmacia Bioten公司);高效液相色譜儀及熒光檢測器(日本島津公司)。

1.3 大鼠大腦中動脈缺血/再灌注模型的制備 參照Longa等［4］制備大鼠右側大腦中動脈阻斷局灶性腦缺血/再灌注模型。從栓線插入成功開始計算缺血時間，2 h后將暴露在外的栓線拔出2 cm。再灌注達2、6、12、24、48 h后觀察并處死動物，每個時相點動物數不少于6只。假手術組只分離出頸內動脈，不插入尼龍魚線。

1.4 造模成功的判斷標準 參照Longa等［4］的評分標準對大鼠神經功能進行評分。將0分及4分大鼠剔除，1～3分為模型制作成功，納入實驗;假手術組大鼠只出現同側Homer征，而無對側神經功能缺損現象。實驗過程中，手術失敗、造模不成功及24 h內死亡的動物均棄之不用，隨機補充。

1.5 腦梗死體積測定 再灌注后48 h，快速斷頭取腦，將腦組織放置于-20℃冰箱內，20 min后取出;切除額極，連續冠狀切5片，每片厚約2 mm，將此5片腦組織置于現配之2%三苯基四氮唑溶液中，避光置于37℃孵育箱中30 min，再置于甲醛溶液中浸泡1 d;將浸泡1 d的5片腦組織按順序排列后拍照，照片用Image master圖像分析儀分析腦梗死面積及陽性面積，再乘以厚度，經計算得出梗死體積百分比。

1.6 谷氨酸測定

1.6.1 樣品處理 麻醉大鼠迅速斷頸取鼠腦，置于冰上操作，取缺血半暗帶腦組織(根據TTC染色，參考Hong等［5］的方法，并加以改進)約50 mg，加200 μL無水乙醇在冰臺上磨成勻漿，吸出勻漿液，在18 000 r/ min、4℃條件下離心20 min，取25 μL上清液測定谷氨酸含量。

1.6.2 衍生化反應 取50 mg鄰苯二甲醛溶于1 mL甲醇中，充分溶解后加入30 μL β巰基乙醇，用0.4 mol/L硼酸緩沖液(pH 9.5)稀釋至5.0 mL，搖勻避光4℃冷藏備用。取25 μL腦組織上清液，加入100 μL衍生化試劑，反應1 min后立即進樣，進樣量為10 μL。

1.7 統計學方法 采用SPSS 16.0軟件進行統計分析，計量資料用均數±標準差)表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠再灌注48 h時腦梗死體積比較 與假手術組比較，缺血/再灌注組相對腦梗死體積增加(P＜0.05)，MC組相對腦梗死體積均有所下降，差異有統計學意義(P＜0.05)(表1)。

表1 各組大鼠再灌注48 h時腦梗死體積比較

2.2 各組大鼠再灌注各時間點谷氨酸濃度比較假手術組各時間點谷氨酸水平為0 μg/mL，缺血/再灌注組再灌注各時間點對應谷氨酸水平持續增高，高峰為24 h，與假手術組對應時間點谷氨酸濃度比較，差異有統計學意義(P＜0.05);MC組谷氨酸濃度各時間點谷氨酸濃度與缺血/再灌注組對應時間點濃度比較均顯著下降，差異有統計學意義(P＜0.05)(表2)。

表2 各組大鼠再灌注各時間點谷氨酸濃度比較 (mg/L)

3 討論

谷氨酸是中樞神經系統主要的興奮性神經遞質，對神經系統正常功能的維持發揮著重要作用。同時，谷氨酸在神經系統內的大量釋放和堆積又是引起神經細胞損傷的關鍵因素。正常情況下，細胞外的谷氨酸由谷氨酸轉運體維持在較低水平。病理情況下，這一調節機制發生異常。發生腦缺血時，能量耗竭導致細胞膜內外離子濃度的變化，進而改變谷氨酸轉運體的轉運方向。另外，膜內外離子濃度的變化還增加了神經元的興奮性導致神經元興奮及谷氨酸大量釋放，進一步導致谷氨酸釋放增加。文獻報道缺血/再灌注后谷氨酸的釋放有兩個高峰:一是在缺血30 min時，另一個峰值出現在再灌注早期［6］。Hara等［7］研究發現缺血后海馬組織的谷氨酸水平立即升高并且在缺血后7 d仍持續較高水平，提示谷氨酸在腦缺血中發揮長時間的作用。谷氨酸能神經元是腦內主要的興奮性神經元。這些神經元之間的傳遞及調節維持腦主要功能。其功能異常與許多腦部疾病有關。神經元在某種情況下被過度激活稱為興奮毒性，最終導致神經元死亡。興奮毒性是腦缺血損傷、外傷性腦損傷及癲癇的關鍵機制之一。它也是阿爾茨海默病、帕金森病、肌萎縮側索硬化癥等腦病的重要發病機制之一。興奮毒性以突觸釋放過多的谷氨酸為特點，反過來激活突觸后的谷氨酸受體，介導興奮毒性所致的細胞死亡。降低缺血后腦組織谷氨酸的濃度可以減輕興奮毒性，達到神經保護作用。

MC是第二代半合成的四環素類抗生素，具有高親脂性，易透過血腦屏障，有效抗革蘭陽性菌及革蘭陰性菌［8］。除了最基本的抗菌活性外，其還具有抗炎癥、抗凋亡及抗氧化作用［9］。目前其確切機制尚不完全清楚。Yrj?nheikki等［10］首先發表了MC在腦缺血中的神經保護作用。小腦顆粒細胞使用MC (150 mmol/L)處理后再給予 N-甲基-天冬氨酸(100 mmol/L)處理30 min，24 h后檢測神經元活力，結果顯示N-甲基-天冬氨酸處理細胞活力減少35%，MC預處理的細胞未出現細胞活力下降，提示MC對N-甲基-天冬氨酸誘導的興奮毒性有保護作用［11］。

本實驗采用大鼠腦缺血/再灌注模型，結果顯示與缺血/再灌注組比較，MC組相對腦梗死體積均有所下降(P＜0.05)，但MC低劑量組、高劑量組之間腦梗死體積相比差異無統計學意義(P＞0.05)，提示大鼠腦缺血/再灌注后給予MC處理可改善腦缺血/再灌注損傷引起大鼠的神經功能缺損，減少腦梗死體積。谷氨酸測定證實，MC可通過減少谷氨酸生成抑制腦缺血后興奮毒性作用，發揮保護神經元的作用。目前MC有效安全的治療窗及適應證還不確定。MC目前正處于早期的臨床試驗階段［12］。臨床實踐表明長期服用≤200 mg/d劑量的MC，人體可獲得良好的安全性和耐受性［13］。目前臨床上尚無關于MC治療缺血性腦血管病的劑量，其應用于臨床治療的安全性和有效性等問題還需進一步研究。本實驗研究發現MC低劑量組與高劑量組腦梗死體積及谷氨酸測定等方面均差異無統計學意義，提示低劑量MC有神經元保護作用，與 Yenari等［14］的研究報道一致。

綜上所述，有關MC在急性腦梗死方面特別是超早期口服及靜脈給藥途徑下神經保護作用，將進行更多臨床的和基礎的實驗。探討MC神經保護作用的機制、有效劑量、治療時間窗及適應證有重要的臨床意義，值得更深入研究。

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