claudin-7和E-cadherin在結腸癌/直腸癌組織中的表達和意義

王諄

(鄭州市第三人民醫院普外科，鄭州450000)

結腸癌、直腸癌在臨床較常見，侵襲和轉移是其預后不良的重要因素。claudins家族是構成細胞緊密連接的重要成分之一，其異常表達與腫瘤的侵襲轉移相關，目前人們關注最多的是claudin-7［1］。上皮黏附素(E-cadherin)對調節細胞外的黏附有重要作用，近年來相關研究認為其與claudins家族可能具有協同作用［2］。本實驗對結腸癌、直腸癌標本進行claudin-7和E-cadherin的流式細胞學檢測，探討其臨床價值，以期為臨床研究結腸癌、直腸癌的發展及判斷預后提供理論支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2007年6月至2008年12月在我院確診為結腸癌、直腸癌并進行手術的患者122例為觀察組，其中男62例，女60例，年齡36～78(53.3 ±5.4)歲，留取新鮮組織，并于 -80℃冰箱中保存。上述患者均符合WHO關于結腸癌、直腸癌的診斷標準。排除標準:術前放、化療的患者、臨床資料不完整的患者。收集同期經病理證實為正常結腸黏膜組織的患者60例為對照組，其中男30例，女30例，年齡36～79(52.5±5.7)歲，保存方法同上。兩組患者在性別、年齡等方面比較差異無統計學意義，具有均衡性。

1.2 方法 claudin-7和E-cadherin蛋白均購自武漢博士德公司。claudin-7和E-cadherin的檢測采用流式細胞術。將凍存組織取出，置于75%的乙醇中固定72 h后，將組織放在120目的不銹鋼網上，剪碎后輕搓，并用0.9%的氯化鈉溶液沖洗。收集混懸液后離心，并制成1×106/mL的單細胞懸液。分別取1 mL加入 claudin-7或 E-cadherin蛋白，室溫放置30 min后加入磷酸鹽緩沖液10 mL，離心，去上清液，加異硫氰酸熒光素-IgG二抗100 μL，避光放置30 min，加入磷酸鹽緩沖液10 mL，離心，棄上清后加磷酸鹽緩沖液0.1 mL，過濾后應用流式細胞儀進行檢測［3］。采用美國BD公司生產流式細胞儀進行檢測，并用系統自帶軟件進行分析。

1.3 結果判斷方法 應用的方法計算出熒光指數表示蛋白的相對含量［3］。熒光指數=(蛋白表達的平均熒光強度-對照樣本的平均熒光強度)/(正常對照樣本的表達-對照樣品的平均熒光強度)

1.4 統計學方法 采用SPSS 12.0軟件進行統計分析，計量資料用均數±標準差)表示，采用t檢驗;計數資料比較采用χ2檢驗;相關分析采用Pearson線性相關分析;生存分析應用Kaplan-Meier法，生存曲線的比較采用Log-rank檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組claudin-7和E-cadherin的表達 兩組claudin-7和E-cadherin比較差異有統計學意義(P＜0.05) (表1)。

表1 兩組claudin-7和E-cadherin的表達 (%)

2.2 觀察組claudin-7和E-cadherin在不同臨床病理特征中的比較 claudin-7和E-cadherin在不同腫瘤直徑、Dukes分期、Ki67值及有無淋巴結轉移的結腸癌、直腸癌患者中比較差異有統計學意義(表2)。

2.3 兩組claudin-7和E-cadherin表達的相關性分析 觀察組claudin-7與E-cadherin蛋白的表達呈正相關(r=0.45，P＜0.05);對照組claudin-7與E-cadherin的表達未見明顯相關性(r=0.12，P＞0.05)。

2.4 觀察組claudin-7和E-cadherin表達的生存分析 以熒光指數≥1.0為陽性，結腸癌、直腸癌claudin-7陽性患者3年生存率為85%(34/40)，claudin-7陰性患者3年生存率為29.23%(24/82)，差異有統計學意義(χ2=8.54，P＜0.05);結腸癌、直腸癌E-cadherin陽性患者3年生存率為83.8%(31/37)，E-cadherin陰性患者3年生存率為31.8%(27/85)，差異有統計學意義(χ2=7.42，P＜0.05)，claudin-7和E-cadherin低表達患者的預后較差。

3 討論

結腸癌、直腸癌臨床常見，腫瘤細胞在轉移過程中細胞間的黏附作用降低，細胞連接松散。鈣黏附素是一組Ca2+依賴跨膜蛋白，包括至少9個基因家族，主要參與介導鈣離子依賴的同型細胞間的黏附，在維持正常組織結構方面發揮著重要作用。也有觀點認為E-cadherin是介導同型細胞相互黏附的跨膜糖蛋白［2］。在正常組織中E-cadherin遍布在胚胎組織和上皮細胞中，不僅有調節原始胚胎組織發育的作用，還參與細胞間的物質的交換和信息的交流，同時對保持細胞、組織的完整性有重要價值。在E-cadherin的表達丟失時，引起同質類型細胞黏附性差，并脫離原發灶，具有血行和淋巴道轉移的潛能［4］。claudins是構成緊密連接的骨架蛋白，是緊密連接結構與功能的重要組成成分。Claudins家族的NH2-和COOH-端位于細胞內部，C末端可與內層的蛋白(如ZO-1、ZO-2等)分子連接;細胞外的肽鏈可以形成兩個跨膜的環，這兩個環可以和鄰近的其他細胞的同種類型環相接觸而行使功能［5-6］。claudin-7是Claudins多基因家族中的重要成員之一，目前認為claudin-7是潛在的腫瘤抑制劑［7-8］。

本實驗結果顯示，結腸癌、直腸癌中claudin-7和E-cadherin低表達，提示兩者對腫瘤發生有重要作用，即claudin-7和E-cadherin高表達可以抑制腫瘤的發生，反之亦然。實驗結果顯示 claudin-7和E-cadherin的表達與腫瘤直徑、Dukes分期、Ki67值及淋巴結轉移有一定關系，由于以上因素均與患者的預后相關，提示claudin-7和E-cadherin的表達可能與預后有一定關聯。生存分析直接證實了claudin-7和E-cadherin與預后的相關性。實驗結果顯示，claudin-7和E-cadherin的表達呈正相關，提示兩者具有協同作用。E-cadherin的異常表達可以促進腫瘤的浸潤和轉移，其異常表達時引起癌細胞從原發灶的癌組織中分離并脫落，同時引起N-cadherin的表達增強，使腫瘤細胞與脈管的內皮細胞或周圍的基質成分的黏附性增強，引起轉移的發生。因此，Claudin-7蛋白可以成為細胞與細胞間緊密連接成分的重要基礎，對細胞的屏障功能和極性的維持有重要價值，此結構可以有效地限制癌細胞的營養供應，進而發揮抑癌作用。當Claudin-7蛋白低表達時，細胞的緊密連接功能損害，細胞與細胞間松散，此時與E-cadherin引起的黏附性下降共同作用，引起腫瘤擴散的發生，同時也可以使腫瘤生長時產生的促腫瘤生長因子隨之擴散。E-cadherin還對腫瘤細胞與血管平滑肌細胞或外皮細胞之間的黏附發揮著重要作用，主要表現為促進腫瘤間質的血管形成及腫瘤細胞-間質細胞的遷移，使腫瘤更加富有侵襲性［9］。

綜上所述，結腸癌、直腸癌中claudin-7和E-cadherin異常表達，兩者在腫瘤的發生、發展中具有重要作用，術后聯合檢測claudin-7和E-cadherin的表達對判斷結腸癌、直腸癌的預后有重要價值。

［1］ Ozgüven BY，Kara?etin D，Kabuk?uoˇglu F，et al.Immunohistochemical study of E-cadherin and β-catenin expression in colorectal carcinomas［J］.Pol J Pathol，2011，62(1):19-24.

［2］ Matsuoka T，Mitomi H，Fukui N，et al.Cluster analysis of claudin-1 and-4，E-cadherin，and β-catenin expression in colorectal cancers［J］.J Surg Oncol，2011，103(7):674-686.

［3］ 龐久玲，馬征，劉軍，等.Smad3和轉化生長因子β1在瘢痕疙瘩、增生性瘢痕及正常皮膚中的表達［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2010，14(11):1927-1930.

［4］ 劉愛東，劉士生，許志萍，等.E-cadherin在胃癌中的表達及意義［J］.廣東醫學，2007，28(11):1806-1807.

［5］ Bornholdt J，Friis S，Godiksen S，et al.The level of claudin-7 is reduced as an early event in colorectal carcinogenesis［J］.BMC Cancer，2011，11:65.

［6］ Jakab C，Rusvai M，Gálfi P，et al.Expression of claudin-1，-3，-4，-5 and-7 proteins in low grade colorectal carcinoma of canines［J］.Histol Histopathol，2010，25(1):55-62.

［7］ Darido C，Buchert M，Pannequin J，et al.Defective claudin-7 regulation by Tcf-4 and Sox-9 disrupts the polarity and increases the tumorigenicity of colorectal cancer cells［J］.Cancer Res，2008，68 (11):4258-4268.

［8］ Oshima T，Kunisaki C，Yoshihara K，et al.Reduced expression of the claudin-7 gene correlates with venous invasion and liver metastasis in colorectal cancer［J］.Oncol Rep，2008，19(4):953-959.

［9］ Lioni M，Brafford P，Andl C，et al.Dysregulation of claudin-7 leads to loss of E-cadherin expression and the increased invasion of esophageal squamous cell carcinoma cells［J］.Am J Pathol，2007，170(2): 709-721.