結直腸癌TNM分期與循環DNA水平關系的臨床研究

閆 巍 徐 智

(北京大學第三醫院普外科，北京 100191)

結直腸癌TNM分期與循環DNA水平關系的臨床研究

閆 巍 徐 智*

(北京大學第三醫院普外科，北京 100191)

目的 探討結直腸癌TNM分期與循環DNA水平的關系。 方法 選擇2010年3月～2011年9月42例結直腸癌患者，術前檢測循環DNA和癌胚抗原(CEA)水平，術后病理確定TNM分期;同期檢測14例健康人循環DNA水平作為對照組。 結果 健康人循環 DNA水平(22.14±16.16)μg/L，結直腸癌循環 DNA水平:Ⅰ期(79.85±53.08)μg/L，Ⅱ期(77.21 ±40.46)μg/L，Ⅲ期(85.66 ±39.87)μg/L，Ⅳ期(145.52 ±51.72)μg/L。結直腸癌Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期循環 DNA 水平明顯高于健康人(P＜0.05);結直腸癌Ⅳ期明顯高于其他各期，差異有顯著性(P＜0.05);Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期之間循環DNA水平差異無顯著性(P＞0.05);循環DNA水平在不同年齡段、性別、腫瘤部位間差異無顯著性(P＞0.05)。CEA與循環DNA水平之間無直線相關關系(r=0.153，P=0.333)。 結論 循環DNA水平檢測具有微創、標本獲取容易、可重復檢測的優點，它有可能在結直腸癌早期診斷方面成為有價值的腫瘤標志物。

結直腸癌;TNM分期; 循環DNA; 腫瘤標志物

循環DNA是存在于血漿中的DNA，也稱細胞外DNA或游離 DNA。有數據顯示［1］健康人循環DNA含量極微，約在5μg/L左右。Leon等［2］首先觀察到腫瘤患者循環DNA水平升高的現象，隨后越來越多的研究表明循環DNA與腫瘤關系密切，腫瘤生長過程中不斷釋放DNA進入血循環。循環DNA水平變化在一定程度上可以反映原發腫瘤的特征，這為研究腫瘤提供了更方便的途徑。本研究旨在了解結直腸癌TNM分期與循環DNA水平的關系，以及癌胚抗原(CEA)與循環DNA的相關關系。

1 臨床資料與方法

1.1 一般資料

選擇2010年3月～2011年9月間42例結直腸癌患者作為研究對象，男27例，女15例。年齡39～79歲，平均62.2歲。術后經病理證實并進行TNM分期:Ⅰ期4例，Ⅱ期7例，Ⅲ期25例，以上各期均行根治性切除術，Ⅳ期6例，其中肝轉移2例行原發灶+轉移灶切除，腹腔內轉移4例，3例并發腸梗阻行姑息性腫瘤切除+腸造口術，1例無腸梗阻行姑息性腫瘤切除。

1.2 方法

1.2.1 循環DNA檢測 42例結直腸癌患者術前取3 ml外周靜脈血，置EDTA抗凝試管中4℃保存，2 h內分離血漿:3000 r/min離心10 min，取上清液，再以3000 r/min離心10 min，取上清液，獲完全無血細胞成分的血漿約1 ml，置－80℃冰箱保存。同期取我院14例健康人體檢血標本作為對照組，血漿分離保存方法同上。使用MACHEREY-NAGEL公司NucleoSpin Plasma XSKit試劑盒提取血漿循環DNA，方法按試劑盒說明進行。使用Invitrogen公司Qubit dsDNA HSAssay Kit試劑盒進行循環DNA定量。首先應用特異性雙鏈DNA熒光染料和Buffer配制工作液;取5μl標準品與195μl工作液混勻，配成標準品上樣體系;取2μl純化的血漿循環DNA樣品與198μl工作液混勻，配成樣品上樣體系;最后用Qubit 2.0熒光計對標準品及血漿樣品進行測定，根據標準曲線換算出樣品中的DNA含量。

1.2.2 CEA測定 42例結直腸癌患者術前取外周血3 ml。使用ABBOTT公司i2000SR化學發光儀Architect I系統，采用化學發光微粒子免疫分析技術(CMIA)檢測血CEA水平。

1.2.3 統計學處理 采用SPSS17.0進行統計學分析。2組間循環DNA的差異采用兩獨立樣本t檢驗，多組間差異應用One-Way ANOVA，兩兩比較應用Student-Newman-Keuls;應用Spearman相關分析檢驗CEA與循環DNA水平相關性。

2 結果

2.1 不同臨床特征的循環DNA水平

見表1。結直腸癌循環DNA水平在不同年齡段、性別、腫瘤部位之間差異無顯著性(P=0.293，0.244，0.135)。健康人與結直腸癌Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期患者5組間循環DNA水平差異有顯著性(F=12.530，P=0.000)。結腸癌Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期循環DNA水平明顯高于健康人(q=3.800，4.441，7.103，9.439，P ＜0.05);結直腸癌Ⅳ期出現遠處轉移(肝轉移、腹腔轉移)，循環DNA水平明顯高于Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期(q=3.798，4.583，4.915，P ＜0.05);Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期之間循環DNA水平差異無顯著性(P ＞0.05)。

表1 不同年齡段、性別、腫瘤部位、TNM分期結直腸癌患者循環DNA水平(±s)

表1 不同年齡段、性別、腫瘤部位、TNM分期結直腸癌患者循環DNA水平(±s)

*患者與健康人共5組比較

項目 n 循環DNA(μg/L)統計值健康人14 22.14 ±16.16患者 42 92.25 ±46.88年齡段 39～50歲 7 73.90±62.42 F=1.267，P=0.293 51 ～70 歲 24 90.00 ±39.44 70 ～79 歲 11 108.82 ±50.44性別 男 27 98.59 ±45.57 t=1.182，P=0.244女15 80.83 ±48.60腫瘤部位 盲腸升結腸 8 111.85±54.58 F=1.970，P=0.135橫結腸 4 114.23 ±14.13降結腸乙狀結腸 10 65.61 ±53.08直腸 20 93.34 ±40.50 TNM分期 Ⅰ期 4 79.85±53.08 F=12.530，P=0.000*145.52 ±51.72Ⅱ期 7 77.21 ±40.46Ⅲ期 25 85.66 ±39.87Ⅳ期6

2.2 CEA與循環DNA的相關性

42例結直腸癌患者CEA水平呈偏態分布，0.5～1129 μg/L，中位數4.6 μg/L。循環DNA 水平呈正態分布，(92.25±46.88)μg/L。Spearman 相關分析顯示，r=0.153，P=0.333，因此 CEA 與循環DNA之間無明顯直線相關關系。

3 討論

結直腸癌是最常見的腫瘤之一，其病死率和生存率與腫瘤分期有明顯關系，Ⅰ期5年生存率為95%，Ⅳ期 ＜5%［3］，因此，對結直腸癌早期診斷并進行正確治療可以明顯提高生存率。目前常用的結直腸癌的篩查方法是糞便潛血試驗、CEA和結腸鏡檢查，但糞便潛血試驗和 CEA 的敏感性較低［4，5］，結腸鏡屬有創性操作，且費用偏高［6］，因此，近些年人們對循環DNA作為腫瘤早期診斷方法的興趣日益濃厚［7］。

3.1 TNM分期與循環DNA水平的關系

研究表明乳腺癌患者循環DNA水平比健康人明顯增高，而且不依賴于腫瘤的大小和分期［8］;對肺癌的研究表明循環DNA水平在Ⅰa期已明顯增高，并且循環DNA水平在不同性別、年齡、組織分型、腫瘤分期之間沒有明顯差別［9］。本研究顯示Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期結直腸癌患者循環DNA水平均較健康人明顯升高，Ⅳ期出現肝轉移和腹腔轉移后，循環DNA水平較其他各期(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期)又明顯升高，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期之間循環DNA水平差異無顯著性，而且其水平與年齡段、性別、腫瘤部位無明顯關系，因此，循環DNA水平在結直腸癌早期(Ⅰ期)即已增高的現象對腫瘤早期診斷具有參考意義，它有可能成為結直腸癌早期診斷的較敏感指標。

3.2 CEA與循環DNA的相關性

CEA是結直腸癌應用最廣泛的血清標志物，它診斷早期癌的敏感性約為30% ～40%［4，10］。有研究報道應用循環DNA診斷結直腸癌的敏感性為81.3%，而聯合CEA和循環DNA檢測敏感性上升到88%［5］。本組資料顯示，結直腸癌患者 CEA和循環DNA水平之間無明顯的直線相關關系，這種非線性相關關系可能正是CEA與循環DNA聯合檢測可以提高結直腸癌診斷敏感性的理論依據。CEA和循環DNA水平聯合檢測有可能成為一種快速微創的、相對價廉的、更加敏感的早期診斷結直腸癌的工具［5］。

總之，循環DNA水平測定具有微創、標本獲取容易、可重復檢測的優點，它有希望在結直腸癌的早期診斷方面成為有價值的腫瘤標志物。

1 Suzuki N，Kamataki A，Yamaki J，et al.Characterization of circulating DNA in healthy human plasma.Clin Chim Acta，2008，387(1－2):55－58.

2 Leon SA，Shapiro B，Sklaroff DM，et al.Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy.Cancer Res，1977，37(3):646－650.

3 Coleman MP，Rachet B，Wods LM，et al.Trends and socioeconomic inequalities in cancer survival in England and Wales up to 2001.Br JCancer，2004，90(7):1367 －1373.

4 Winawer S，Fletcher R，Rex D，etal.Colorectal cancer screening and surveillance:clinical guidelines and rationale-update based on new evidence.Gastroenterology，2003，124(2):544 －560.

5 Flamini E，Mercatali L，Nanni O，et al.Free DNA and carcinoembryonic antigen serum levels:an important combination for diagnosis of colorectal cancer.Clin Cancer Res，2006，12(23):6984－6988.

6 Bromer MQ，Weinberg DS.Screening for colorectal cancer-now and the near future.Semin Oncol，2005，32(1):3 －10.

7 Khair G，Monson JR，Greenman J.Epithelial molecular markers in the peripheral blood of patients with colorectal cancer.Dis Colon Rectum，2007，50(8):1188 －1203.

8 Gai S，Fidler C，Lo YM，et al.Quantitation of circulating DNA in the serum of breast cancer patients by real-time PCR.Br J Cancer，2004，90(6):1211 －1215.

9 Sozzi G，Conte D，Mariani L，etal.Analysisof circulating tumor DNA in plasma at diagnosis and during follow-up of lung cancer patients.Cancer Res，2001，61(12):4675 －4678.

10 Fernandes CL，Kim SB，Matos D.Cytokeratins and carcinoembryonic antigen in diagnosis， staging， and prognosis of colorectal adenocarcinoma.World JGastroenterol，2005，11(5):645 －648.

(責任編輯:王惠群)

Correlation between the TNM Staging and Levelof Circulating DNA in Colorectal Cancer:Clinical Study

YanWei，XuZhi.DepartmentofGeneralSurgery，PekingUniversityThirdHospital，Beijing100191，China

ObjectiveTo investigate the correlation between the TNM staging and level of circulating DNA in colorectal cancer.MethodsA total of 42 patients with colorectal cancer，who were admitted to our hospital from March 2010 to September 2011，were enrolled into this study.In all the cases，we determined the levels of circulating DNA and CEA preoperatively and TNM staging postoperatively.Meanwhile，the level of circulating DNA was detected in 14 healthy adults as a control group.ResultsThe mean level of circulating DNA was(22.14 ±16.16)μg/L in healthy adults，which was significantly lower than that detected in the stagesⅠ，Ⅱ，Ⅲ，and Ⅳ colorectal cancer［(79.85 ±53.08)μg/L，(77.21 ± 40.46)μg/L，(85.66 ± 39.87)μg/L，and(145.52 ±51.72)μg/L，respectively，allP＜0.05］.In the cases of colorectal cancer，patients in stage Ⅳ showed significantly higher level of circulating DNA than other stages(allP＜0.05).No significantdifferencewas detected among the stagesⅠ，Ⅱ andⅢ(P＞0.05)，nor among different age groups，sex groups，or patients with the tumor at different positions(P＞ 0.05).No linear correlation existed between the levels of CEA and circulating DNA(r=0.153，P=0.333).ConclusionsDetection of circulating DNA has advantages of minimal invasion，easy access to specimen，and repeatability.It can be a valuable tumor marker in early diagnosis of colorectal cancer.

Colorectal cancer;TNM Staging;Circulating DNA;Tumormarker

R735.04

A

1009－6604(2012)06－0512－03

* 通訊作者，E-mail:xuzhi123456@sohu.com

2012－03－27)

2012－05－02)

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