組蛋白去乙酰化酶1、3在炎癥牙周膜中的表達(dá)

肖 蕊，劉大勇，趙夢(mèng)明，荊曉艷，賈 智

(天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院，天津300070)

組蛋白乙酰化屬于表觀遺傳學(xué)的范疇，是一種不涉及DNA序列改變的可遺傳的基因表達(dá)變化過程［1］。組蛋白乙酰化狀態(tài)受兩類酶 — 組蛋白乙酰化轉(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferases，HAT)和組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases，HDAC)的調(diào)節(jié)［2］。組蛋白乙酰化和去乙酰化作用是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)中基因表達(dá)的重要過程，有研究表明，HDAC是參與炎癥基因轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞增殖的關(guān)鍵因子［3］。哺乳類HDAC可分為4組，共18種:組I (HDAC 1、HDAC 2、HDAC 3、HDAC 8)在大多數(shù)細(xì)胞中普遍存在，主要位于細(xì)胞核，調(diào)控組蛋白的乙酰化修飾;組Ⅱ(HDAC 4、HDAC 5、HDAC 6、HDAC 7、HDAC9、HDAC10)常頻繁穿梭于細(xì)胞核內(nèi)和胞漿之間，調(diào)控組蛋白和非組蛋白的乙酰化修飾;組Ⅲ(Sirt 1、Sirt 2、Sirt 3、Sirt 4、Sirt 5、Sirt 6、Sirt 7)能夠使p53去乙酰化，從而導(dǎo)致p53介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄、凋亡等一系列生物學(xué)活動(dòng)失去作用;組Ⅳ(HDACll)可能與免疫耐受有關(guān)。

牙周炎是牙周組織慢性感染性疾病，是成人失牙的主要原因，并且與許多全身性病相關(guān)，如糖尿病、心血管疾病、新生兒早產(chǎn)和低體質(zhì)量?jī)旱取Ｑ乐苎椎陌l(fā)生過程是以牙周致病菌為始動(dòng)因子而引起的機(jī)體過度免疫反應(yīng)，并最終導(dǎo)致牙周組織破壞。研究證實(shí)，牙周炎免疫反應(yīng)具有自身免疫反應(yīng)的特征［4］，且在發(fā)病機(jī)制、治療等方面與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有許多相似之處［5－6］。

與骨關(guān)節(jié)炎和正常滑膜組織相比，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的HDAC 1過表達(dá)［7］。研究表明［8］:一種新型HDAC 3選擇性抑制劑－MI192能減少類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周血單核細(xì)胞(PBMC)中IL－6的產(chǎn)生，從而緩解其免疫炎癥反應(yīng)。然而，牙周炎的發(fā)生與牙周組織中乙酰化狀態(tài)的改變是否有關(guān)尚未見報(bào)道。本研究通過比較炎癥牙周膜與健康牙周膜中HDAC 1、HDAC 3的表達(dá)，初步探討HDAC與牙周炎發(fā)病的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

TransZol Up、TransScript Two－Step RT－PCRsuperMix、DNAmarker(全式金，北京);引物(上海生工);瓊脂糖、梯度PCR儀(MJ Research公司，美國);電泳凝膠成像儀(Vitbertourmat公司，法國)。

1.2 組織樣本采集

所選病例均來自天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院門診患者，實(shí)驗(yàn)組選擇20～55歲慢性牙周炎患者20例，納入標(biāo)準(zhǔn):①探診深度(PD)≥5 mm，臨床附著水平(CAL)≥5 mm，X線片示牙槽骨吸收≥根長的1/2;②牙齒松動(dòng)≥Ⅲ度，需要拔除患牙。排除標(biāo)準(zhǔn):①藥物、妊娠等導(dǎo)致的牙齦增生;②患有糖尿病等全身性病;③吸煙者。對(duì)照組選擇20～55歲牙周健康［探診深度(PD)≤3 mm，無附著喪失，無牙齦出血或紅腫］者20例，均無全身性病，不吸煙且有需要拔除的正畸減數(shù)牙或智齒。收集符合以上標(biāo)準(zhǔn)的所有受試者被拔除的牙齒，并刮取根中1/3牙周膜組織置無酶無菌的凍存管內(nèi)，液氮罐中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 RT－PCR檢測(cè)炎癥及健康牙周膜中HDAC 1，HDAC 3的表達(dá)

1.3.1 引物合成

HDAC 1上游引物:5'－AGCCAAGAGAGTCAAAACAGA－3';下游引物:5'－GGTCCATTCAGGCCAACT－3';產(chǎn)物長度102 bp。HDAC 3上游引物:5'－TGGCTTCTGCTATGTCAACG－3';下游引物:5'－GCACGTGGGTTGGTAGAAGT－3';產(chǎn)物長度308 bp。GAPDH上游引物:5'－GTCAGTGGTGGACCTGACCT－3';下游引物:5'－AGGGGAGATTCAGTGTGGTG－3';產(chǎn)物長度413 bp。以上引物均由上海生工生物技術(shù)公司合成。

1.3.2 提取總RNA

將上述凍存的組織樣本轉(zhuǎn)移至液氨預(yù)冷的研缽中，研磨至粉狀后，每50～100 mg組織中加入1 mL TransZol繼續(xù)研磨。然后轉(zhuǎn)移至EP管，室溫靜置 5 min，加入 0.2 mL氯仿劇烈震蕩，12 000 r/min 4℃離心15 min，取無色水相上層;加入0.5 mL異丙醇析出沉淀，12 000 r/min 4℃離心10 min，棄上清;用1 mL無RNA酶的750 mL/L乙醇洗滌沉淀，7 500 r/min 4℃離心5 min，棄上清，室溫干燥形成膠狀沉淀。將膠狀沉淀用10 μL RNA溶解液溶解后，取1 μL稀釋100倍，用紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定280 nm和260 nm處的吸光度值(OD)，以評(píng)定其濃度和純度。最后根據(jù)測(cè)定值調(diào)整RNA標(biāo)本濃度為1 μg/μL。

1.3.3 cDNA第一鏈合成和多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)

嚴(yán)格按照TransScript Two－Step RT－PCR super-Mix試劑盒說明進(jìn)行。首先合成cDNA第一鏈，合成體系20 μL:總RNA50 ng～5 μg;Anchored OLigo 1 μL;2×TS Reaction Mix 10 μL;TransScript RT/RI Enzyme Mix 1 μL，Rnase－free Water to 20 μL。然后PCR擴(kuò)增HDAC 1、HDAC 3和內(nèi)參GAPDH。

PCR反應(yīng)體系25 μL:cDNA 1 μL;上游引物1 μL;下游引物1 μL;2×TransTaqTM HiFi PCR SuperMix 12.5 μL;ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)條件為: 94℃變性5 min后，94℃變性30 s，HDAC1，56℃; HDAC 3，59℃;GAPDH，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)后72℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物行溴化乙啶染色(EB染色)瓊脂糖凝膠電泳，觀察并照相。

1.3.4 灰度值分析

用Quantity One軟件對(duì)電泳圖進(jìn)行灰度值分析，以樣品灰度值與同一樣品GAPDH的灰度值之比作為評(píng)價(jià)HDAC 1，HDAC 3表達(dá)量的指標(biāo)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組比較用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α= 0.05。

2 結(jié)果

在炎癥牙周膜和健康牙周膜組織中均有HDAC1、HDAC 3表達(dá)(圖1)。經(jīng)灰度值分析，HDAC1、HDAC3在炎癥牙周膜中的表達(dá)均明顯高于健康牙周膜，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖2)。

圖1 炎癥和健康牙周膜中HDAC 1、HDAC 3的表達(dá)

圖2 炎癥、健康牙周膜中HDAC 1、HDAC 3相對(duì)灰度值比較

3 討論

由于核心組蛋白富含帶正電荷的堿性氨基酸，與DNA具有高度親和性，能阻礙基本轉(zhuǎn)錄單位蛋白質(zhì)復(fù)合物進(jìn)入啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)，而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄功能受到抑制。組蛋白氨基末端特定部位ε－氨基酸的乙酰化可中和其正電荷，減弱核小體中堿性氨基酸與DNA的靜電吸引力，增加轉(zhuǎn)錄因子的進(jìn)入，從而促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄。因此，組蛋白的乙酰化和去乙酰化與基因的表達(dá)調(diào)控密切相關(guān)。負(fù)責(zé)組蛋白乙酰化和去乙酰化的是兩種功能相互拮抗的蛋白酶HAT和HADC，兩者之間的動(dòng)態(tài)平衡控制著染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和基因的表達(dá)。當(dāng)HDAC過度表達(dá)并被轉(zhuǎn)錄因子募集，就會(huì)導(dǎo)致特定基因的不正常抑制，從而導(dǎo)致炎癥性自身免疫病等其他疾病。

乙酰化修飾在炎癥性自身免疫性疾病中起重要作用，其中包括組蛋白乙酰化修飾和非組蛋白乙酰化修飾。組蛋白乙酰化修飾是基因轉(zhuǎn)錄激活的重要標(biāo)志。當(dāng)炎癥信號(hào)傳至核內(nèi)、轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子結(jié)合后，可進(jìn)一步募集P300/CBP等共刺激因子，他們作用于組蛋白N端的賴氨酸殘基使其發(fā)生乙酰化修飾［9］。非組蛋白的乙酰化修飾包括NF－КB等的乙酰化修飾。近期研究發(fā)現(xiàn)，乙酰化等翻譯后修飾在NF－КB的亞細(xì)胞定位、DNA結(jié)合力、轉(zhuǎn)錄活性等方面起重要調(diào)節(jié)作用［10］。當(dāng)炎癥刺激因子作用于機(jī)體時(shí)，P38等MAPK信號(hào)通路的激活可磷酸化P300并激活HAT活性，還可乙酰化P65，增加NF－КB與КB序列的結(jié)合能力啟動(dòng)NFКB介導(dǎo)的炎癥相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄［11］。IL－1、IL－6啟動(dòng)子上均有NF－КB結(jié)合位點(diǎn)，其基因轉(zhuǎn)錄受NF－КB調(diào)控，NF－КB活化后促進(jìn)炎癥因子基因轉(zhuǎn)錄從而增加炎癥相關(guān)蛋白的表達(dá)［12］。有研究發(fā)現(xiàn): HDAC 1、HDAC 3可直接或間接與NF－КB結(jié)合，在NF－КB去乙酰化中發(fā)揮一定作用［13－14］。

本結(jié)果顯示:牙周炎患者牙周膜中HDAC 1、HDAC 3 mRNA表達(dá)明顯高于牙周健康者(與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎研究類似［7－8］)，打破了組蛋白乙酰化和去乙酰化的動(dòng)態(tài)平衡，有可能促進(jìn)了NF－КB介導(dǎo)的炎癥因子的表達(dá)，參與了牙周炎癥反應(yīng)的基因調(diào)控。

研究證實(shí):由于可以減少炎癥因子的產(chǎn)生，組蛋白去乙酰化酶抑制劑(histone deactylase inhibitor，HDACi)在體內(nèi)外具有免疫調(diào)節(jié)作用［15－16］。HDACi可以調(diào)節(jié)NF－КB信號(hào)通路，從而降低炎癥因子和轉(zhuǎn)錄因子的水平［17－18］。HDACi已被用于治療多種炎癥性自身免疫病，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘、銀屑病、多發(fā)性硬化病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等［19－20］。局部用藥能降低系統(tǒng)毒性和有關(guān)的副作用［21］。局部應(yīng)用組蛋白去乙酰化抑制劑可能會(huì)為牙周炎治療開辟一條新途徑。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)HDAC 1、HDAC 3在炎癥牙周組織中高表達(dá)，該結(jié)果雖初步從表觀遺傳學(xué)的角度探索了牙周炎可能的發(fā)病機(jī)制，但組蛋白乙酰化和去乙酰化過程調(diào)控牙周炎癥免疫反應(yīng)的確切機(jī)制，以及組蛋白去乙酰化酶抑制劑能否成為牙周炎治療的潛在藥物，還需進(jìn)一步研究證實(shí)。

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