Rab7負向調控巨噬細胞中CpG誘導的細胞因子的表達①

王 娜 王玉珍 萬永青 謝基明 康鴻斌 劉春霞

(內蒙古農業大學生命科學學院，呼和浩特010018)

Rab7負向調控巨噬細胞中CpG誘導的細胞因子的表達①

王 娜 王玉珍 萬永青 謝基明②康鴻斌③劉春霞

(內蒙古農業大學生命科學學院，呼和浩特010018)

目的:研究Rab7過表達及失活突變(Rab7T22N)對CpG刺激的RAW264.7巨噬細胞中分泌細胞因子的影響。方法:采用RT-PCR和Real-time PCR檢測RAW264.7細胞中Rab7在CpG刺激下表達模式。將Rab7真核表達質粒及失活突變質粒Rab7T22N通過脂質體法轉染RAW264.7細胞，G418穩定篩選，Western法鑒定表達效果。用CpG刺激穩定表達Rab7的RAW264.7細胞系，RT-PCR和Real-time PCR檢測細胞因子IL-6、IL-1β、IFN-β的表達量變化。結果:CpG刺激RAW264.7后，Rab7 mRNA表達水平逐漸增高，在8小時達到高峰，表達增高近4倍。Rab7過表達后，CpG刺激后產生的IL-6、IL-1β、IFN-β顯著降低。巨噬細胞中Rab7失活突變后，在CpG刺激后IL-6、IL-1β、IFN-β的表達又顯著增加。結論:CpG促進RAW264.7巨噬細胞中Rab7 mRNA的表達，Rab7抑制了CpG刺激的巨噬細胞中IL-6、IL-1β、IFN-β的表達，該抑制作用的發揮與其酶活性的GTP結合有關。該研究為進一步闡明Rab7在CpG/TLR9信號通路中的作用奠定了基礎。

Rab7;CpG;Rab7T22N;RAW264.7細胞

Rabs(Ras related proteins in brain)蛋白是Ras樣GTP酶超家族中一個較大分支。Rab蛋白家族成員的一個顯著特征是特異的定位于細胞質中的某些亞細胞器，從而參與調節細胞內所有的膜運輸過程[1]。Rab蛋白能在 GDP結合的非活性形式和GTP結合的活性形式之間轉換，調控著囊泡的轉運，如囊泡的形成、轉運、錨著以及融合等過程。

Rab7屬Rab蛋白家族，在早期內體到晚期內體以及晚期內體到溶酶體的膜泡轉運中發揮了重要的作用[2]。Rab7通過促進溶酶體的運輸還可以清除胞內病毒[3]。Rab7除了調控內吞過程的晚期運輸外，還參與了受體的轉運，如將血管緊張素Ⅱ受體1A、表皮生長因子受體轉運到溶酶體降解[4，5]。但關于Rab7是否或怎樣參與調節天然免疫中TLR9信號通路還有待探索。

CpG DNA是細菌、分枝桿菌和其它原核生物DNA中含有的一些具有免疫學活性的短核苷酸序列，大多含有非甲基化的CpG結構[6]，它與人工合成的寡脫氧核糖核酸CpG ODN均可以刺激多種哺乳動物的免疫細胞。大量的研究表明，CpG具有種屬特異性，即不同序列的CpG具有不同的免疫活性，相同序列的CpG對于不同動物的免疫活性也不同。國內外的研究人員經過大量的試驗，明確了5′-GACGTT-3′的CpG基序是對小鼠淋巴細胞最具有免疫增殖效應的，而對人的淋巴細胞有最佳刺激活性的是5′-GTCGTT-3′，5′-TCCATCACGTTCCTGACGTT-3′(CpG1826)和5′-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3′(CpG2006)。且CpG誘導的活化效應是由TLR9介導的[7]。TLRs是一類重要的模式識別受體(Pattern recognition receptors，PRR)，主要是通過識別病原微生物中保守的病原體相關的分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，產生趨化因子和細胞因子，啟動天然免疫應答，從而構成了機體免疫反應的第一道防線[8]。然而，TLRs的過分活化或者活化不正常則可能使自身免疫疾病惡化，或導致系統性細胞因子的大量釋放而導致機體死亡[9]。例如DNA-Ig免疫復合體可使TLR9活化且產生過量的Ⅰ型干擾素，可以引起系統性紅斑狼瘡的發生[10]。因此，為了防止TLRs的不恰當活化，對于TLRs信號通路的負向調控機制需要進一步闡明。

本試驗采用小鼠單核/巨噬細胞株RAW264.7作為模型，研究Rab7在TLR9配體CpG刺激下的表達模式;并通過構建的Rab7的過表達和失活突變載體，研究Rab7過表達和失活突變后對CpG激活的巨噬細胞RAW264.7中Ⅰ型干擾素和炎性因子的影響。本實驗為進一步研究Rab7在TLR9信號通路中的作用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞株和主要試劑 小鼠巨噬細胞系RAW264.7購自北京協和細胞庫;DMEM培養基、胰蛋白酶購自Sigma公司;胎牛血清購自蘭州民海生物工程有限公司;含有CpG基序的寡核苷酸序列CpG ODN(5′-TCCATGACGTTCCTGATGCT-3′)，由上海生工生物工程有限公司合成，全鏈硫代修飾; Rab7抗體，actin抗體購自Santa Cruz公司;細胞總RNA抽提試劑Trizol、反轉錄酶、Taq DNA聚合酶來自TaKaRa;SYBR RTQ-PCR試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司;其他試劑均為分析純。

1.2 小鼠巨噬細胞株RAW264.7的培養及轉染RAW264.7細胞株接種于含 10%胎牛血清的DMEM培養基中;置37℃，5%CO2的培養箱培養，1～2 天傳代一次。pcDNA3.1、pcDNA3.1/mRab7、pcDNA3.1/tRab7三種質粒參照Lipofectamine 2000的說明書進行轉染。用800 μg/ml G418的DMEM培養基穩定篩選。置37℃、5%CO2的培養箱培養，1～2天傳代一次。

1.3 細胞總RNA的提取，cDNA的制備及定量分析 總RNA采用Trizol試劑根據說明書進行抽提。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，測定RNA濃度后用1 μg的RNA反轉錄為cDNA。RT-PCR和Real-time PCR使用的引物序列為:Rab7-sense:5′-ACAATAGGAGCGGACTTTCTGACC-3′;Rab7-antisence: 5′-TTGGCACTGGTCTCGAAGTAAGG-3′;IL-6-sence:5′-TTCTTGGGACTGATGCTG-3′;IL-6-antisence:5′-GAC TCTGGCTGGCTTTGTCTTTCT-3′;IL-1β-sence:5′-TTGGGGTCC GTCAACTTC-3′;IL-1β-antisence:5′-CTAATAGGCTCATCTGGG-3′;IFN-β-sence:5′-CGTTCCTGCTGTGCTTCT-3′;IFN-β-antisence:5′-GTCCGCCCTGTAGGTGAG-3′。Real-time PCR 采 用 ABI 7300 (Applied Bio-systems，USA)和 SYBR RT-PCR kit檢測分析，計算方法采用 2-ΔΔct法。

1.4 統計學分析 應用SPSS17.0軟件進行t檢驗分析，P＜0.05時認為具有顯著差異，P＜0.01時認為具有極顯著差異。

2 結果

2.1 CpG刺激 RAW264.7細胞后 Rab7 mRNA水平表達時效關系研究 本實驗首先研究在CpG誘導TLR9信號通路時是否會影響Rab7的表達。通過CpG刺激RAW264.7細胞不同時間后用RT-PCR研究Rab7 mRNA的表達變化。如圖1A所示，CpG刺激后Rab7的mRNA表達水平在8小時的時候表達量最高，Rab7 mRNA表達水平的總體趨勢為先增高后再恢復。接著我們通過Real-time PCR進一步驗證。如圖1B所示，CpG刺激4小時后Rab7的表達水平是初始表達的兩倍多，而8小時時Rab7的表達水平達到最高，是初始表達的4倍。以上結果均顯示CpG正向調控Rab7的表達。由此我們推測Rab7可能參與了CpG/TLR9信號轉導途徑。

2.2 轉染細胞中Rab7的表達 將篩選好的穩定表達的細胞株通過Western blot進一步確認細胞株是否穩定轉染。結果如圖2所示，轉染Rab7過表達和失活突變質粒的細胞Rab7的表達量明顯大于轉染空質粒的細胞。因此可以說明三種質粒的轉染細胞株均可以使用。

2.3 Rab7抑制CpG誘導的巨噬細胞中IL-6和IL-1β的表達 為了闡明Rab7在CpG誘導的TLR9的信號轉導通路中的作用，我們首先觀察了Rab7對CpG刺激巨噬細胞分泌細胞因子的影響。IL-6、IL-1β的分泌主要是受MyD88依賴的途徑調控。如圖3和圖4所示，Rab7過表達后，顯著地抑制了CpG誘導的 RAW264.7細胞 IL-6、IL-1β的分泌。相反的，失活突變的Rab7可以促進IL-6、IL-1β的分泌。這些結果說明，Rab7對CpG誘導的RAW 264.7細胞IL-6、IL-1β的抑制作用依賴于其與GTP結合的活性形式。

2.4 Rab7抑制了CpG誘導的IFN-β的表達 前面的研究結果顯示，Rab7能夠通過結合GTP的活性形式抑制CpG誘導的IL-6和IL-1β的分泌，而這兩個細胞因子的釋放是依賴TLR9-MyD88信號通路的。而IFN-β是受轉錄因子IRF7調控，因此，我們通過RT-PCR和Real-time PCR檢測了Rab7過表達和失活突變后對CpG刺激的RAW264.7巨噬細胞IFN-β產生的影響。如圖5A、B所示，Rab7過表達后，顯著地抑制了 IFN-β的表達，而失活突變的Rab7卻能促進IFN-β的表達，說明Rab7對CpG誘導的RAW264.7細胞IFN-β的抑制作用依賴于其與GTP結合的活性形式。

圖1 CpG刺激RAW264.7不同時間后Rab7的變化Fig.1 Detection of Rab7 expression in RAW264.7 macrophages with CpG stimulation for indicated time

圖2 穩定轉染細胞Rab7表達水平圖Fig.2 Detection of Rab7 expression in transformed cells

圖3 Rab7抑制了RAW264.7細胞中CpG誘導的IL-6的表達Fig.3 Rab7 inhibited the expression of IL-6 in RAW 264.7 after stimulation with CpG

圖4 Rab7抑制了RAW264.7細胞中CpG誘導的IL-1β的表達Fig.4 Rab7 inhibited the expression of IL-1β in RAW 264.7 after stimulation with CpG

圖5 Rab7抑制了RAW264.7細胞中CpG誘導的IFN-β的表達Fig.5 Rab7 inhibited the expression of IFN-β in RAW 264.7 after stimulation with CpG

3 討論

Rabs蛋白家族的一個顯著特征是能夠在GTP結合的活性形式和GDP結合的非活性形式之間轉換。在之前Rab7的相關研究中發現，將Rab7第22位的蘇氨酸(T)突變為天冬酰胺(N)即Rab7T22N后，該突變體可以降低與GDP/GTP的親和力，Rab7表現為功能喪失。即野生型Rab7能夠與GTP結合，而突變體 Rab7T22N不能與 GTP結合，因此Rab7T22N被稱為失活突變體[11]。但關于Rab7以及Rab7T22N與TLR9信號通路之間的關系，還未見報道。本實驗通過之前構建的Rab7過表達和突變體，研究Rab7過表達和失活突變后對CpG激活的巨噬細胞RAW264.7中Ⅰ型干擾素和前炎性因子的影響，結果顯示，過表達Rab7能夠抑制CpG誘導的細胞因子的表達，該研究為Rab7與TLR9的信號轉導打下了基礎。

TLRs受體是一類古老的天然免疫受體，先前的研究表明，TLR9被其相應的配體激活后通過依賴MyD88的信號通路發揮抗病毒作用。TLR9除了依賴 MyD88-IRAK-TRAF6-TAK1-NF-κB/MAPKs 信號通路產生炎性因子、共刺激分子和趨化因子之外，也依賴MyD88-IRAKs-IRF7信號通路誘導Ⅰ-IFN等多種細胞因子的釋放[12，13]。通過我們的實驗發現，Rab7參與了TLR9信號通路的調控，這為Rab家族其他成員的功能研究提供了新的思路。其次還發現Rab7過表達后不僅抑制了前炎癥因子IL-6、IL-1β的表達，同時也抑制了Ⅰ型干擾素IFN-β的產生，而將Rab7失活突變后卻可以逆轉這種效應。說明Rab7發揮作用依賴于其GTP的結合活性。通過本實驗發現了一個新的TLR9的負向調控因子Rab7，該結果對進一步深入研究TLR9引起的生物效應與相應信號通路的調控機制提供了新的線索和實驗基礎。

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3 Brumell J，Scidmore M.Manipulation of rab GTPase function by intracellular bacterial pathogen[J].Microbiol Mol Biol Rev，2007;71 (4):636-652.

4 Dale L B，Seachrist J L，Babwah A V et al.Regulation of angiotensinⅡ type 1A receptor inracellular retention，degradation，and recycling by Rab5，Rab7，and Rab11 GTPases[J].J Biol Chem，2004;279 (13):13110-13118.

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10 Bird P，Trapani J，Villadangos J.Endolysosomal Proteases and the inhibltors in inununlty[J].Nat Rev Immunol，2009;9(12):871-882.

11 Bucci C，Thomsen P，Nicoziani P et al.Rab7:a key to lysosome biogenesis[J].Mol Biol Cell，2000;11(2):467-480.

12 Kumar H，Kawai T，Akira S.Toll-like receptors and innate immunity[J].Biochem Biophys Res Commun，2009;388(4):621-625.

13 Blasius A，Beutler B.Intracellular toll-like receptors[J].Immunity，2010;32(3):305-315.

[收稿2012-01-09 修回2012-03-16]

(編輯 倪 鵬)

Rab7 negatively regulates cytokines expression in macrophages induced by CpG

WANG Na，WANG Yu-Zhen，WAN Yong-Qing，XIE Ji-Ming，KANG Hong-Bin，LIU Chun-Xia.College of Life Sciences，Inner Mongolia Agricultural University，Huhhot 010018，China

Objective:To analyze the effect of Rab7 overexpression or overexpression of dominant negative mutant form of Rab7 (Rab7T22N)on the production of cytokines in RAW264.7 macrophages induced by CpG.MethodsRT-PCR and Real-time PCR was used to measure the induced expression pattern of Rab7 in RAW264.7 cells stimulated by CpG.The eukaryotic expression vector of Rab7 and Rab7T22N were transfected into RAW264.7 cells by the methods of liposome，and screened by G418.The constant overexpression of Rab7 was verified by Western blot.The production of IL-6，IL-1β and IFN-β were measured with RT-PCR and Real-time PCR after transfected RAW264.7 cells were stimulated by CpG.ResultsThe Rab7 mRNA expression in RAW264.7 cells was gradually increased after stimulated with CpG，and the peak expression was at 8h，with about 4 times as much as the base expression.Overexpression of Rab7 inhibited CpG induced expression of IL-6，IL-1β and IFN-β in RAW264.7 cells.However，overexpression of Rab7T22N significantly promoted the expression of the above cytokines in RAW264.7 macrophages induced by CpG.ConclusionCpG induced the expression of Rab7 mRNA in RAW264.7 cells.Rab7 inhibits the expression of IL-6，IL-1β and IFN-β in CpG stimulated Raw264.7 cells.The inhibition effect of Rab7 is associated with the enzyme activity of GTP-binding.The experiments may lay a foundation for further study of the role of rab7 in CpG/TLR9 signaling pathways.

Rab7;CpG;Rab7T22N;RAW264.7 cell

R392.11

A

1000-484X(2012)08-0681-04

10.3969/j.issn.1000-484X.2012.08.002

①本文為國家自然科學基金(30801001)和內蒙古自治區自然科學基金項目(2010MS0513，2011MS1112)

②內蒙古醫院檢驗科，呼和浩特010020

③內蒙古醫學院附屬醫院，呼和浩特010050

王 娜(1986年-)，女，在讀碩士，主要從事天然免疫調控方面的研究，E-mail:wangna1986320@163.com;

及指導教師:王玉珍(1976年-)，女，副教授，碩士生導師，主要從事天然免疫調控方面的研究，E-mail: wangyuzhen817@eyou.com。

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