熱帶剝爪螨變應原Blo t 5的克隆表達、純化及免疫學鑒定①

蔡俊龍 楊 彬 鄧宜紅 陳 實 羅慕俠 李 勤 付永鋒 程訓佳

(復旦大學上海醫學院病原生物學系，上海200032)

熱帶剝爪螨變應原Blo t 5的克隆表達、純化及免疫學鑒定①

蔡俊龍 楊 彬 鄧宜紅 陳 實 羅慕俠 李 勤 付永鋒 程訓佳

(復旦大學上海醫學院病原生物學系，上海200032)

目的:克隆熱帶剝爪螨主要變應原Blo t 5基因，表達純化該蛋白，并檢測其免疫活性。方法:提取熱帶剝爪螨總RNA，采用RT-PCR的方法擴增Blo t 5編碼基因，將其連入原核表達載體pET-19b，將重組質粒轉化入大腸桿菌BL21 Star (DE3)pLysS，IPTG誘導表達后，通過Ni2+親和層析純化重組變應原Blo t 5。用Dot blot、Western blot和ELISA等方法檢測重組變應原Blo t 5免疫活性。結果:Dot blot和Western blot結果表明重組變應原Blo t 5和熱帶剝爪螨粗提液都能和Blo t 5鼠單克隆抗體結合。重組變應原Blo t 5檢測69份熱帶剝爪螨過敏患者血清和21份戶塵螨過敏患者血清中的特異性IgE，陽性率分別為29.0%和33.3%。結論:表達和純化了具有與天然蛋白相似的免疫活性的重組熱帶剝爪螨變應原Blo t 5，可用于熱帶剝爪螨變應原的標準化，為標準化抗原的臨床特異性診斷與治療奠定基礎。

熱帶剝爪螨;重組變應原;Blo t 5;蛋白表達;IgE

塵螨(Dust mites)普遍存在于人類居住和工作的室內環境中，因此也稱屋塵螨(House dust mites，HDM)，其在世界范圍內是過敏性疾病的主要危險因素之一[1]。流行病學資料顯示，在全球范圍內，蚍螨科的戶塵螨(Dermatophagoides pteronyssinus)和粉塵螨(Dermatophagoides farinae)是最常見的螨種，而在熱帶和亞熱帶地區，甘(食)螨科的熱帶剝爪螨(Blomia tropicalis)是主要的螨種[2]。熱帶剝爪螨含有多種變應原，近年來，通過免疫印跡方法從熱帶剝爪螨中分離鑒別出至少25種變應原[3]。已正式命名的有 Blo t 1、Blo t 3、Blo t 4、Blo t 5、Blo t 6、Blo t 10、Blo t 11、Blo t 12、Blo t 13、Blo t 19 和 Blo t 21 等11種[4-11]。Blo t 5是熱帶剝爪螨的主要變應原，絕大多數熱帶剝爪螨過敏患者的血清IgE對它呈高反應性[12，13]，也有報導認為 Blo t 21也是主要的變應原[4]。至今，Blo t 5的生物學功能還不清楚。最近的研究發現Blo t 5主要存在于熱帶剝爪螨的中腸和后腸以及糞便中[4]。Naik等[14]用核磁共振的方法研究Blo t 5的結構，發現它的空間結構有兩個很靠近的表位，分別有完整的抗體互補決定區(Complementarity-determining regions，CDRs)，有很好的抗原抗體結合性。本研究從培養的熱帶剝爪螨獲得Blo t 5基因并在大腸桿菌中進行表達，建立大量制備并純化具有天然免疫活性的重組變應原Blo t 5的方法，為特異性診斷與免疫治療奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 熱帶剝爪螨 本室分離并培養，培養采用封閉式容器，溫度(25±2)℃，相對濕度75%。

1.1.2 質粒載體和表達菌 質粒載體pET-19b購自美國Novagen公司;大腸桿菌JM109感受態細胞購自大連TaKaRa公司;大腸桿菌BL21 Star(DE3) pLysS購自美國Invitrogen公司。

1.1.3 主要實驗材料 Rneasy Total RNA kit購自德國Qiagen公司;GeneAmp RNA PCR Kit購自美國Perkin-Elmer公司;His-結合樹脂購自 Novagen公司;Pyrobest DNA多聚酶、堿性磷酸酶(CIAP)、100 bp Ladder Maker、λHind Ⅲ DNA Markers、Ligation Kit、限制性內切酶 NdeⅠ和 XhoⅠ等購自大連TaKaRa公司;辣根過氧化物酶(HRP)偶聯的山羊抗人IgE、HRP-山羊抗小鼠IgG購自Zymed公司;DAB底物顯色試劑盒購自天根生化科技有限公司;引物合成與測序由上海Invitrogen公司完成;抗Blo t 5鼠單克隆抗體1E1、6A11和1C10由本實驗室自制，4℃保存;熱帶剝爪螨過敏患者血清和戶塵螨過敏患者血清來自福建莆田人民醫院和海南省人民醫院，陰性血清取自健康志愿者，-20℃保存。

1.2 方法

1.2.1 熱帶剝爪螨粗提液的制備 活體熱帶剝爪螨以丙酮脫脂3次，繼以乙醚脫脂4小時以上，離心棄上清，室溫揮發干燥。脫脂后的螨體以1∶25(W/ V)加入PBS，冰浴超聲后，4℃ 14 000 r/min離心20分鐘，取上清。

1.2.2 重組表達質粒的構建 挑取克隆化培養的熱帶剝爪螨，按照Rneasy Total RNA Kit的使用說明，提取總 RNA;以 GeneAmp RNA PCR Kit進行RT-PCR，獲得cDNA。根據GenBank公布的熱帶剝爪螨變應原Blo t 5的mRNA序列(U59102.1)設計特異性引物，并在引物5′端加上限制性酶切位點。上 游 引 物:5′-CCCATATGAAGAAGGATGATTTCCGAA-3′，含 Nde Ⅰ酶切位點;下游引物:5′-CCCTCGAGTTATTGGGTTTGAATATC-3′，含 Xho Ⅰ酶切位點。以cDNA為模板，PCR擴增編碼熱帶剝爪螨變應原Blo t 5成熟肽段的基因片段。經純化的PCR產物以NdeⅠ和XhoⅠ酶切后，插入pET-19b載體中構建表達質粒。然后將其轉化入大腸桿菌JM109，將菌液涂布于LB瓊脂板(含氨芐青霉素50 μg/ml)，37℃過夜培養后，提取質粒，進行雙酶切鑒定與測序鑒定。

1.2.3 重組變應原 Blo t 5的表達 重組質粒pET19b-Blo t 5轉入大腸桿菌BL21 Star(DE3) pLysS后，挑取單菌落入400 ml LB培養液中(含氨芐青霉素 50 μg/ml)，37℃振搖培養至 OD600約為0.5時，加入1 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside，IPTG)，37℃誘導3小時后，4℃ 10 000 r/min離心10分鐘，收集細菌沉淀。超聲后，12.5%SDS-PAGE電泳，觀察結果。

1.2.4 重組變應原Blo t 5的純化 參照Novagen公司的Ni-NTA His-Bind Resin使用說明，細菌沉淀中，加入20 ml Binding buffer，冰上超聲后，加入200 μg/ml溶菌酶混勻，30℃振搖30分鐘后，冰上超聲，4℃ 14 000 r/min離心20分鐘，上清液用Ni2+親和層析法純化蛋白。以12.5%的SDS-PAGE電泳檢測蛋白純度。以BCA Protein Assay試劑盒測定蛋白濃度后，4℃冰箱保存。

1.2.5 Dot blot檢測 參照楊柳等[15]法進行 Dot blot檢測。分別將 2 μg 重組變應原 Blo t 5、5 μg 熱帶剝爪螨粗提液和2 μg重組隱孢子蟲子孢子表面蛋白P23(rP23)加樣于硝酸纖維素膜上，室溫干燥。以含3%脫脂奶的PBS濕盒內室溫封閉1小時。分別加鼠單克隆抗體1E1、6A11和1C10，室溫孵育1小時。分別加HRP-goat Anti-mouse IgG抗體(1∶250稀釋)，室溫孵育1小時。以DAB底物顯色試劑盒顯色20分鐘。

1.2.6 Western blot檢測 參照楊柳等[15]方法進行 Western blot檢測。重組變應原 Blo t 5 0.1 μg、熱帶剝爪螨粗抗原5 μg和BSA 0.1 μg每道進行還原SDS-PAGE電泳后，電轉到醋酸纖維素膜上。以含3%脫脂奶的PBS于濕盒內室溫封閉1小時。分別加單克隆抗體1E1、6A11和1C10，室溫孵育1小時。分別加HRP-goat Anti-mouse抗體(1∶250稀釋)，室溫孵育1小時。以DAB底物顯色試劑盒顯色，20分鐘后終止反應，觀察結果。

1.2.7 ELISA 檢測 重組變應原 Blo t 5以0.05 mol/L、pH9.6 的碳酸鹽緩沖液稀釋至 5 μg/ml，每孔用0.1 ml包被酶標板，4℃過夜。以含1%脫脂奶的PBS于濕盒內室溫封閉1小時。分別加熱帶剝爪螨、戶塵螨過敏患者血清和健康體檢者血清(1∶10稀釋)37℃ 孵育 2小時。HRP-goat-Anti-Human IgE抗體室溫孵育1小時。最終用OPD顯色，反應30分鐘終止反應。

1.3 統計學分析 以SPSS軟件，采用成組t檢驗方法對熱帶剝爪螨、戶塵螨過敏患者血清和健康體檢者血清與重組變應原Blo t 5反應性進行統計分析。

2 結果

2.1 RT-PCR反應擴增Blo t 5基因 以RNA提取試劑盒提取熱帶剝爪螨的總RNA，通過RT-PCR反應擴增出Blo t 5蛋白編碼基因，PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示在350 bp左右處有明顯條帶，大小與理論值(355 bp)相符(圖1)。

2.2 重組表達載體的構建與序列分析 經純化的PCR產物以 NdeⅠ和 XhoⅠ雙酶切后，插入pET19b表達載體中。表達載體pET19b-Blo t 5經NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切，電泳結果表明目標條帶與Blo t 5基因片段的PCR產物大小一致。對Blo t 5基因片段進行測序鑒定，與GenBank中公布的序列(U59102.1)進行比對，結果表明Blo t 5基因片段與U59102.1 一致。

圖1 Blo t 5基因PCR產物2%瓊脂糖凝膠電泳分析Fig.1 2%argarose gel electrophoresis analysis of PCR production of Blo t 5 gene

2.3 重組變應原 Blo t 5的表達 以重組質粒pET19b-Blo t 5轉入大腸桿菌 BL21 Star(DE3) pLysS，挑取轉化子培養，進行誘導表達，菌體經超聲破碎后，進行SDS-PAGE分析，結果顯示在分子量約為17 kD處有明顯條帶。重組蛋白主要以可溶形式表達，經His-結合樹脂純化后純度可達99%以上(圖2)。使用BCA Protein Assay試劑盒檢測純化后蛋白的濃度，結果表明每升培養液能夠得到純化重組變應原80 mg。

2.4 Dot blot檢測 重組變應原Blo t 5蛋白和熱帶剝爪螨粗提液都可與單克隆抗體1E1、6A11和1C10特異性結合，而無關蛋白重組隱孢子蟲子孢子表面蛋白P23無反應性(圖3)。

圖2 重組蛋白Blo t 5的SDS-PAGE分析圖Fig.2 SDS-PAGE analysis of the recombinant Blo t 5

圖3 目的蛋白Blo t 5的Dot blot鑒定Fig.3 Dot blot analysis of Blo t 5 protein

2.5 Western blot 經過還原條件SDS-PAGE轉膜后，用單克隆抗體1E1、6A11和1C10分別作用于重組蛋白和天然蛋白，重組蛋白在17 kD處有明顯條帶，天然蛋白在14 kD處有明顯條帶(圖4)。抗Blo t 5單克隆抗體可與重組熱帶剝爪螨變應原Blo t 5蛋白特異性結合。

圖4 目的蛋白Blo t 5的Western blot鑒定Fig.4 Western blot analysis of Blo t 5 protein

圖5 熱帶剝爪螨過敏患者、戶塵螨過敏患者和健康體檢者的血清對純化后Blo t 5的反應性Fig.5 IgE-binding capacity of purified Blo t 5 to sera from patients allergic to B.tropicalis or HDM and health control

2.6 ELISA檢測 用重組變應原Blo t 5檢測69份熱帶剝爪螨過敏患者血清中的IgE，其中20份血清反應成陽性，陽性率為29.0%，表明重組變應原Blo t 5免疫活性良好。為了解重組變應原Blo t 5戶塵螨過敏患者血清的反應性，用ELISA檢測其IgE反應性，陽性率為33.3%，反應性略低于熱帶剝爪螨過敏的患者血清，差別沒有統計學意義(P＞0.05，圖5)。

3 討論

在眾多的變應原中螨類是最主要的變應原，花粉、真菌次之。螨變應原是引起變態反應性疾病的重要病因之一，也是引起兒童變應性哮喘的獨立且重要的危險因子。塵螨主要包括戶塵螨、粉塵螨和熱帶剝爪螨。在熱帶和亞熱帶地區熱帶剝爪螨為主要的螨種。陳實等[16，17]在海南進行的大規模人群的變應原皮膚點刺檢測和過敏性哮喘患兒對螨類血清特異性IgE檢測，發現對熱帶剝爪螨的陽性率高于85%。因此，熱帶剝爪螨變應原對于變態反應性疾病的診斷與治療具有重要意義。但是粗提螨浸液成分復雜，含有不同比例的各種變應原或者非變應原，處理不當可能含有內毒素[18，19]，很難達到真正的標準化生產，同時也限制了其安全使用，而應用重組蛋白的技術可以解決這個問題。

免疫印跡法研究表明熱帶剝爪螨至少有25條與特異性IgE的結合條帶，目前正式命名的有11種[4]。剝爪螨變應原Blo t 5是熱帶剝爪螨的主要變應原蛋白，可被大部分熱帶剝爪螨過敏患者血清中的IgE抗體特異性結合[4]。本研究中69份對熱帶剝爪螨過敏患者血清有20份對重組變應原Blo t 5反應成陽性，陽性率29.0%。重組變應原Blo t 5與熱帶剝爪螨過敏患者反應陽性率的差異，可能是由于不同的檢測方法所導致。另外，對戶塵螨過敏的患者血清對重組變應原Blo t 5的陽性率為33%，反應的平均值略低于對熱帶剝爪螨過敏患者血清，而兩者間平均值差異沒有統計學意義。這提示重組變應原Blo t 5與戶塵螨變應原存在著交叉反應性。而有報道指出Blo t 5與Der p 5之間的序列同源性為 43%，有中度的免疫交叉反應性[20，21]。

本研究制備重組變應原Blo t 5采用的表達載體是pET19b載體，由于其所表達的重組蛋白帶有His標簽，在重組蛋白的N末端有10個組氨酸，便于蛋白的純化而對重組蛋白生物學活性影響不大，因此重組變應原Blo t 5比天然蛋白分子量大2 kD左右。實驗結果表明，重組變應原Blo t 5以可溶蛋白形式表達，表達量高，且通過Ni2+親和層析就可以得到純度很高的重組變應原Blo t 5蛋白。Dot blot中，重組變應原Blo t 5和天然蛋白都能被抗Blo t 5單克隆抗體特異性識別，證實重組變應原和天然蛋白有相同的抗原活性。Western blot檢測顯示重組變應原Blo t 5和天然Blo t 5具有相同的線性表位。可作為對熱帶剝爪螨過敏患者進行診斷和特異性免疫治療的候選分子。

與天然蛋白相比，制備重組蛋白有周期短、成本低等優點。本研究從克隆化培養的熱帶剝爪螨中獲得Blo t 5基因并在大腸桿菌中進行表達，制備純化出具有天然免疫活性的重組熱帶剝爪螨變應原Blo t 5，實現熱帶剝爪螨變應原的標準化，為特異性診斷與免疫治療打下了基礎。同時由于重組變應原Blo t 5和戶塵螨之間存在一定的交叉反應性，因而本研究也為熱帶剝爪螨與其他過敏原的交叉致敏反應的研究奠定了基礎。戶塵螨和熱帶剝爪螨過敏的患者進行脫敏治療時，采用戶塵螨和熱帶剝爪螨聯合免疫治療的療效應該優于僅用戶塵螨免疫治療的療效。

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[收稿2012-03-28 修回2012-05-09]
(編輯 倪 鵬)

Blomia tropicalis allergen Blo t 5:cloning，expression，purification and identification

CAI Jun-Long，YANG Bin，DENG Yi-Hong，CHEN Shi，LUO Mu-Xia，LI Qin，FU Yong-Feng，CHENG Xun-Jia.Department of Medical Microbiology and Parasitology，Shanghai Medical College of Fudan University，Shanghai 200032，China

Objective:To clone，express and purify the gene of the major allergen Blo t 5 from Blomia tropicalis and to investigate its immunological activity.MethodsThe total RNA was acquired from B.tropicalis，then the Blo t 5 gene fragments amplified by RT-PCR were cloned into vector pET-19b and then transformed to E.coli BL21 Star(DE3)pLysS.After inducted by IPTG，the recombinant Blo t 5 was purified by Ni2+chelating affinity chromatography.The immunological activity was identified by Dot blot，Western blot and ELISA.ResultsThe results of Dot blot and Western bolt showed both recombinant Blo t 5 and B.tropicalis extract can specially react with monoclonal antibodies against Blo t 5.The IgE antibodies from serum of 69 B.tropicalis allergic patients and 21 Dermatophagoides pteronyssinus allergic patients were tested.The result showed the positive rates were 29.0%and 33.3%，respectively.ConclusionWe have successfully obtained the recombinant allergen Blo t 5 with immunological activity similar to its native counterpart，which could not only resolve the standardization of natural allergen extracts but also contribute to the design of better strategies for the diagnosis and treatment of allergic respiratory diseases.

Blomia tropicalis;Recombinant allergen;Blo t 5;Protein expression;IgE

R392.8

A

1000-484X(2012)08-0690-05

10.3969/j.issn.1000-484X.2012.08.004①本文受國家高技術研究發展計劃項目(2007AA02Z472)和衛生行業科研專項項目(20082001)資助

蔡俊龍(1986年-)，男，在讀碩士，主要從事過敏性疾病診斷與防治研究;

及指導教師:付永鋒(1977年-)，男，博士，講師，主要從事過敏性疾病診斷、防治和醫學原蟲的致病機制與分子生物學研究，E-mail:yffu@fudan.edu.cn。