Lewis肺癌細(xì)胞TLR4對(duì)Foxp3表達(dá)的調(diào)控

歷 春 楊 巍 張英林 蓋曉東 李 一 付海英

(吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系，長(zhǎng)春130021)

Lewis肺癌細(xì)胞TLR4對(duì)Foxp3表達(dá)的調(diào)控

歷 春①楊 巍 張英林 蓋曉東①李 一 付海英

(吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系，長(zhǎng)春130021)

目的:探討小鼠Lewis肺癌(Lewis lung cancer，LLC)細(xì)胞中TLR4對(duì)Foxp3表達(dá)的調(diào)控作用。方法:選擇LPS為配體活化TLR4，采用RT-PCR方法檢測(cè)LPS在不同濃度(0，1，10 μg/ml)和不同時(shí)間點(diǎn)(12，24，36，48小時(shí))Foxp3 mRNA的表達(dá)量的變化，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)有效濃度LPS 10 μg/ml和最佳作用時(shí)間點(diǎn)24小時(shí)Foxp3蛋白和TLR4蛋白表達(dá)量的變化，RT-PCR和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)anti-TLR4/MD2抗體阻斷TLR4后再用LPS刺激LLC細(xì)胞Foxp3表達(dá)量的變化。結(jié)果:LPS在10 μg/ml濃度作用LLC細(xì)胞后可顯著上調(diào)Foxp3 mRNA的表達(dá)量，與未刺激組相比差異顯著(P ＜0.05);LPS最佳作用時(shí)間為24小時(shí);LPS在10 μg/ml濃度作用LLC細(xì)胞24小時(shí)后可顯著上調(diào)Foxp3蛋白和TLR4蛋白的表達(dá)量，與對(duì)照組相比差異顯著(P ＜0.05);阻斷TLR4后再用LPS刺激LLC細(xì)胞，F(xiàn)oxp3的表達(dá)量較未阻斷組明顯降低(P ＜0.05)。結(jié)論:LLC細(xì)胞TLR4蛋白參與對(duì)Foxp3的表達(dá)調(diào)控，TLR4可能是Foxp3的上游信號(hào)分子。

叉頭蛋白3;Lewis肺癌;Toll樣受體4;脂多糖

叉頭蛋白3(Forkhead box protein 3，F(xiàn)oxp3)是叉頭/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子家族中的一個(gè)成員，是CD4+CD25+調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞(regulatory T cells，Tregs)特異的分子標(biāo)記[1]。研究證實(shí)，腫瘤微環(huán)境中Foxp3作為Tregs發(fā)育和行使功能的決定因素，抑制局部免疫應(yīng)答，促進(jìn)腫瘤的免疫逃逸[2-4]。最近研究發(fā)現(xiàn)Foxp3在腫瘤細(xì)胞也有表達(dá)[5-8]，本課題組已報(bào)道小鼠lewis肺癌細(xì)胞表達(dá)Foxp3，而且Foxp3可模擬Tregs發(fā)揮免疫抑制作用參與肺癌細(xì)胞的免疫逃逸[9]，但肺癌細(xì)胞 Foxp3的表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚不明確。TLR4是Toll樣受體家族(Toll like receptors，TLRs)重要成員之一，最初發(fā)現(xiàn)于免疫細(xì)胞，通過識(shí)別某些外源性或內(nèi)源性配體引發(fā)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在天然免疫和獲得性免疫中發(fā)揮重要作用[10，11]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn) TLR4在很多腫瘤細(xì)胞系和腫瘤組織中也有表達(dá)，腫瘤細(xì)胞通過TLR4信號(hào)通路釋放炎性細(xì)胞因子和免疫抑制因子誘導(dǎo)免疫微環(huán)境的免疫耐受，從而促進(jìn)腫瘤的免疫逃逸[12-14]。有文獻(xiàn)報(bào)道TLR4與Tregs關(guān)系密切，LPS活化TLR4后可增強(qiáng)Tregs的生存、增殖和抑制功能[15，16]，因此我們推測(cè) TLR4 可能參與對(duì)肺癌細(xì)胞Foxp3的表達(dá)調(diào)控。

為了探討TLR4對(duì)肺癌細(xì)胞Foxp3表達(dá)的調(diào)控作用，本研究以小鼠Lewis肺腺癌(Lewis lung cancer，LLC)細(xì)胞為研究對(duì)象，選用LPS活化TLR4和anti-TLR4/MD2抗體阻斷 TLR4，檢測(cè)活化和阻斷TLR4對(duì) Foxp3表達(dá)量的影響，以探討肺癌細(xì)胞Foxp3表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng) LLC細(xì)胞系為本實(shí)驗(yàn)室保存，貼壁生長(zhǎng)在含10%新鮮小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)。

1.2 試劑 MMLV反轉(zhuǎn)錄酶和Ex Taq DNA聚合酶購(gòu)自TaKaRa公司;Anti-mouseTLR4/MD2抗體(MTS510)購(gòu)自eBioscience公司;兔抗鼠Foxp3及TLR4多克隆抗體購(gòu)自武漢博士得生物公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG購(gòu)自北京中杉金橋生物公司。1.3 RT-PCR檢測(cè)目的基因表達(dá) Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，PCR儀擴(kuò)增目的基因片段。Foxp3引物為:上游:5′-CAG CTG CCT ACA GTG CCC CTA G-3′;下游:5′-CAT TTG CCA GCA GTG GGT AG-3′。擴(kuò)增條件:預(yù)變性94℃ 2分鐘，(變性94℃ 30秒，退火60℃ 30秒，延伸72℃ 1分鐘)，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物為382 bp。內(nèi)參β-actin引物為:上游:5′-TGG AAT CCT GTG GCA TCC ATG AAA C-3′;下游 5′-TAA AAC GCA GCT CAG TAA CAG TCC G-3′。擴(kuò)增條件:預(yù)變性94℃ 2分鐘，(變性94℃ 30秒，退火 52℃ 30秒，延伸 72℃ 1分鐘)，共進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物為320 bp。引物由上海生工有限公司合成。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 采用間接免疫熒光法檢測(cè):收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106ml-1;PBS洗滌細(xì)胞1次，1 500 r/min離心5分鐘，棄上清液;加入4%多聚甲醛200 μl固定細(xì)胞，4℃孵育20分鐘; 1 500 r/min離心5分鐘，棄上清液。PBS清洗后離心，棄上清;用破膜劑稀釋兔抗鼠Foxp3多克隆抗體(1∶100)或 PBS稀釋兔抗鼠 TLR4多克隆抗體(1∶100)，4℃孵育 40分鐘;1 500 r/min離心 5 分鐘，棄上清液。再用PBS洗滌細(xì)胞1次，1 500 r/min離心5分鐘，棄上清液;加入FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG(稀釋濃度1∶100)，4℃避光染色30分鐘;1 500 r/min離心5分鐘，棄上清液。用PBS清洗后離心，棄上清;加0.5 ml PBS重懸細(xì)胞后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)平均熒光強(qiáng)度(MFI)，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用±s表示，樣本均數(shù)比較采用多因素方差分析，P ＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度LPS刺激LLC細(xì)胞24小時(shí) Foxp3 mRNA表達(dá)量的變化 首先采用RT-PCR方法檢測(cè)不同濃度 LPS(0、1、10 μg/ml)作用 LLC 細(xì)胞 24 小時(shí)后Foxp3 mRNA表達(dá)量的變化。結(jié)果顯示在1 μg/ml和 10 μg/ml的 LPS 作用下，F(xiàn)oxp3 mRNA 表達(dá)量均有上調(diào)，但以10 μg/ml的LPS最為顯著，與未刺激組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，見圖1。2.2 不同時(shí)間點(diǎn)LPS刺激LLC細(xì)胞Foxp3 mRNA表達(dá)量的變化 進(jìn)一步采用RT-PCR方法取有效濃度10 μg/ml的LPS作用LLC細(xì)胞，檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)(12、24、36、48 小時(shí))Foxp3 mRNA 表達(dá)量的變化。結(jié)果顯示在不同時(shí)間點(diǎn)Foxp3 mRNA的表達(dá)量均有上調(diào)，但以24小時(shí)時(shí)間點(diǎn)Foxp3 mRNA表達(dá)量最高(P ＜0.05)，見圖2。結(jié)果表明LPS活化LLC細(xì)胞

圖1 不同濃度LPS作用LLC細(xì)胞Foxp3 mRNA表達(dá)量的變化Fig.1 The mRNA level of Foxp3 after LPS treatment at different concentration in LLC cells by RT-PCR

TLR4后Foxp3表達(dá)上調(diào)的最佳作用時(shí)間為24小時(shí)。

2.3 LPS刺激LLC細(xì)胞Foxp3蛋白表達(dá)量的變化為進(jìn)一步驗(yàn)證TLR4對(duì)Foxp3的表達(dá)調(diào)控作用，采用流式細(xì)胞術(shù)選用有效濃度10 μg/ml和最佳作用時(shí)間24小時(shí)檢測(cè)LPS刺激LLC細(xì)胞后Foxp3在蛋白水平的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，LPS刺激組Foxp3的MFI(5.11 ±0.56)較未刺激組 MFI(3.67± 0.42)顯著增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜ 0.05)，見圖3。此結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了LLC細(xì)胞TLR4活化后可誘導(dǎo)Foxp3的表達(dá)。

2.4 LPS刺激LLC細(xì)胞TLR4蛋白表達(dá)量的變化TLR4蛋白是LPS信號(hào)向胞內(nèi)傳導(dǎo)的門戶蛋白。因此，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度 LPS(0、1、10 μg/ml)刺激LLC細(xì)胞24小時(shí)時(shí)間點(diǎn)TLR4蛋白量的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，隨著 LPS濃度的增加，TLR4蛋白的表達(dá)量也隨之增強(qiáng)，以LPS 10 μg/ml最為顯著，與LPS活化TLR4后Foxp3的表達(dá)有一致性。LPS 10 μg/ml組 TLR4 的 MFI(12.9 ±1.62)較 LPS 0 μg/ml組 MFI(9.8 ±1.25)顯著增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，見圖4。結(jié)果表明，LPS活化LLC細(xì)胞TLR4后TLR4蛋白表達(dá)上調(diào)。

圖2 不同時(shí)間LPS作用LLC細(xì)胞Foxp3 mRNA表達(dá)量的變化Fig.2 The mRNA level of Foxp3 after LPS treatment at different time in LLC cells by RTPCR

2.5 阻斷TLR4后LLC細(xì)胞Foxp3 mRNA表達(dá)量的變化 前面研究顯示LPS活化TLR4后可誘導(dǎo)Foxp3的表達(dá)，為進(jìn)一步驗(yàn)證TLR4對(duì)Foxp3表達(dá)的調(diào)控作用，我們先用20 μg/ml的anti-TLR4/MD2抗體阻斷 TLR4，再用10 μg/ml LPS刺激 LLC細(xì)胞，RT-PCR方法檢測(cè)Foxp3 mRNA表達(dá)量的變化。結(jié)果顯示阻斷組Foxp3 mRNA的表達(dá)量較未阻斷組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，見圖5，表明阻斷TLR4后可抑制Foxp3的表達(dá)上調(diào)。

圖3 LPS作用下LLC細(xì)胞Foxp3蛋白表達(dá)量的變化Fig.3 The protein level of Foxp3 after LPS treatment in LLC cells by FCM

圖4 LPS刺激LLC細(xì)胞后TLR4蛋白表達(dá)量的變化Fig.4 The protein level of TLR4 after LPS treatment in LLC cells by FCM

圖5 阻斷TLR4后對(duì)Foxp3 mRNA表達(dá)量的影響Fig.5 The mRNA level of Foxp3 after TLR4 blockade in LLC cells by RT-PCR

2.6 阻斷TLR4后LLC細(xì)胞Foxp3蛋白表達(dá)量的變化 為進(jìn)一步驗(yàn)證阻斷LLC細(xì)胞TLR4后Foxp3在蛋白水平的表達(dá)變化，先用 20 μg/ml的 anti-TLR4/MD2 抗體阻斷 TLR4，再用 10 μg/ml LPS 刺激LLC細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Foxp3蛋白量的變化。結(jié)果顯示，阻斷組 Foxp3的 MFI(1.75± 0.19)較未阻斷組 MFI(2.04 ±0.23)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，與其mRNA檢測(cè)的結(jié)果相符，見圖6。此結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)TLR4參與對(duì)Foxp3的表達(dá)調(diào)控。

3 討論

圖6 阻斷TLR4后對(duì)Foxp3蛋白表達(dá)量的影響Fig.6 The protein level of Foxp3 after TLR4 blockade in LLC cells by FCM

Foxp3是Tregs特異的標(biāo)志物及細(xì)胞發(fā)育和功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因[1]。Tregs與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，通過發(fā)揮免疫抑制作用促進(jìn)腫瘤的免疫逃逸[2-4]。最近研究發(fā)現(xiàn)Foxp3在腫瘤細(xì)胞也有表達(dá)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮重要的作用[5-9]，但腫瘤細(xì)胞Foxp3的表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚不明確。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的TLR4與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[17-19]。TLR4通過識(shí)別某些外源性及內(nèi)源性配體引發(fā)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞生成大量的免疫抑制性因子誘導(dǎo)腫瘤微環(huán)境的免疫耐受促進(jìn)腫瘤的免疫逃逸[12-14]。此外，TLR4與Tregs有著密切的聯(lián)系[15，16]。LPS 刺激 TLR4 后可誘導(dǎo) Tregs的活化，增強(qiáng)Tregs細(xì)胞的生存和增殖。更重要的是LPS刺激后，Tregs的抑制效率提高了10倍，表明TLR4活化后可增強(qiáng)Tregs的抑制功能[15]。另有研究表明，在LPS單獨(dú)作用下，Tregs中Foxp3表達(dá)無(wú)明顯變化，但在LPS和IL-2共同作用后，Tregs中Foxp3的表達(dá)較IL-2單獨(dú)作用顯著上調(diào)，Tregs的免疫抑制功能也相應(yīng)增強(qiáng)，而且阻斷TLR4下游NF-κB途徑抑制了Foxp3的表達(dá)上調(diào)，表明TLR4可能間接參與Tregs中Foxp3的表達(dá)調(diào)控[16]。

結(jié)合以上文獻(xiàn)報(bào)道，我們推測(cè)TLR4可能參與對(duì)肺癌細(xì)胞Foxp3的表達(dá)調(diào)控。為證實(shí)此推測(cè)，首先檢測(cè)LPS活化LLC細(xì)胞TLR4后Foxp3的表達(dá)情況，結(jié)果顯示LPS刺激LLC細(xì)胞后Foxp3表達(dá)在基因和蛋白水平均顯著上調(diào)，初步表明 LLC細(xì)胞TLR4活化后可誘導(dǎo)Foxp3的表達(dá)。TLR4蛋白是LPS信號(hào)向胞內(nèi)傳導(dǎo)的門戶蛋白，為進(jìn)一步探討TLR4蛋白在LPS誘導(dǎo)LLC細(xì)胞Foxp3表達(dá)中的作用，我們檢測(cè)了LPS刺激LLC細(xì)胞后TLR4蛋白的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TLR4蛋白的表達(dá)在LPS刺激LLC細(xì)胞后明顯上調(diào)，與LPS誘導(dǎo)Foxp3的表達(dá)上調(diào)有一致性，提示LPS活化TLR4后TLR4蛋白是功能性表達(dá)上調(diào)。

雖然TLR4是識(shí)別LPS的關(guān)鍵受體，但TLR4必需有 MD-2 協(xié)助才能識(shí)別 LPS[20，21]，TLR4 與 MD-2相互作用形成復(fù)合物TLR4/MD2將LPS信號(hào)傳遞入細(xì)胞內(nèi)，激活下游途徑從而引起炎癥因子的大量釋放。因此為進(jìn)一步驗(yàn)證TLR4對(duì)Foxp3的表達(dá)調(diào)控，先用anti-TLR4/MD2抗體阻斷LLC細(xì)胞TLR4，再用LPS刺激，觀察Foxp3的表達(dá)變化。結(jié)果顯示阻斷TLR4后Foxp3的表達(dá)較未阻斷組明顯降低，進(jìn)一步證實(shí)了TLR4對(duì)Foxp3的表達(dá)調(diào)控作用。本研究中LLC細(xì)胞TLR4對(duì)Foxp3的表達(dá)調(diào)控不同于Tregs，Tregs在LPS單獨(dú)作用下Foxp3表達(dá)無(wú)明顯變化，但在LPS和IL-2共同作用下，Tregs中Foxp3表達(dá)明顯上調(diào)[16]，而我們的研究顯示在LPS單獨(dú)作用LLC細(xì)胞后Foxp3表達(dá)明顯上調(diào)，表明TLR4可直接調(diào)控LLC細(xì)胞Foxp3的表達(dá)，TLR4可能是Foxp3的上游信號(hào)分子。

綜合以上結(jié)果，肺癌細(xì)胞TLR4在LPS刺激活化后TLR4蛋白表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步通過誘導(dǎo)Foxp3的表達(dá)促進(jìn)腫瘤的免疫逃逸。TLR4下游信號(hào)通路包括MyD88依賴性和非依賴兩條途徑，而其對(duì)肺癌細(xì)胞Foxp3的調(diào)控作用具體是通過哪條途徑還需進(jìn)一步的深入研究。

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[收稿2012-04-26 修回2012-05-04]
(編輯 倪 鵬)

Regulation of Foxp3 expression by TLR4 in Lewis lung cancer cells

LI Chun，YANG Wei，ZHANG Ying-Lin，GAI Xiao-Dong，LI Yi，F(xiàn)U Hai-Ying.Department of Immunology，Norman Bethune College of Medicine，Jilin University，Changchun 130021，China

Objective:To investigate whether the expression of Foxp3 in Lewis lung cancer(LLC)cells could be regulated by TLR4 activation.MethodsLipopolysaccharide(LPS)was employed as exogenous ligands to activate TLR4.The mRNA level of Foxp3 was detected by RT-PCR at different time points(12，24，36，48 h)upon LPS stimulation(0，1，10 μg/ml).The protein level of Foxp3 and TLR4 was detected by FCM at 24 h time point upon 10 μg/ml LPS stimulation.Foxp3 mRNA and protein were detected by RTPCR and FCM respectively after LPS activation following blockade of TLR4 by anti-TLR4/MD2 antibody.ResultsThe mRNA level of Foxp3 was significantly increased by 10 μg/ml LPS stimulation at 24 hours(P ＜ 0.05).The protein level of Foxp3 and TLR4 were significantly up-regulated at 24 h time point upon 10 μg/ml LPS stimulation(P ＜ 0.05).The expression of Foxp3 protein was significantly decreased in LLC cells with TLR4 blockade followed by LPS stimulation than that of without TLR4 blocking ones(P ＜ 0.05).ConclusionThese results indicate that TLR4 could be involved in the regulation of Foxp3 expression in LLC cells and TLR4 might be the upstream signaling molecules of Foxp3.

Foxp3;Lewis lung cancer;Toll like receptor 4;Lipopolysaccharide

R730.3

A

1000-484X(2012)08-0701-05

10.3969/j.issn.1000-484X.2012.08.006

①北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫教研室，吉林132013

歷 春(1972年-)，女，吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)博士，講師，主要從事腫瘤免疫研究，E-mail:lichunjl@126.com;

及指導(dǎo)教師:付海英(1977年-)，女，博士，講師，主要從事免疫耐受研究，E-mail:fuhaiying612@yahoo.com.cn;

李 一(1961年-)，女，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事免疫耐受研究，E-mail:yilili19@yahoo.com.cn。

·腫瘤免疫學(xué)·