黃芩苷對人淋巴細胞Toll樣受體的調節①

孫 午 熊 鶯 王 敏 姜青龍 龔淑琪 傅穎媛 (南昌大學免疫學教研室，南昌330000)

黃芩苷對人淋巴細胞Toll樣受體的調節①

孫 午②熊 鶯②王 敏 姜青龍 龔淑琪 傅穎媛 (南昌大學免疫學教研室，南昌330000)

目的:研究黃芩苷對人淋巴細胞Toll樣受體(TLR)的調節，探討其在免疫調節方面的作用。方法:1.尼龍毛分離法分離人外周血T和B細胞后使用UF-50流式分析尋找最佳黃芩苷作用濃度;2.采用實時定量熒光RT-PCR，分析在最佳黃芩苷作用濃度處理前后TLRs的表達情況;3.通過加入鼠抗人TLR4單抗進行受體抑制實驗并應用實時定量熒光RT-PCR探討黃芩苷對TLRs的調節位點。結果:1.1 mg/ml的黃芩苷在體外可以顯著促進人T、B淋巴細胞增殖(P＜0.05);2.使用1 mg/ml黃芩苷相對于未用黃芩苷處理的T、B細胞，其TLR3、TLR7、TLR8及TLR9 mRNA的表達均有顯著增加(P＜0.05)，T細胞增加倍數分別為21、15、57和 66倍，B細胞增加的倍數分別為 24、20、61和 63倍，而 TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6及TLR10 mRNAs表達變化不顯著(P＞0.05);3.在1 mg/ml黃芩苷作用下人T、B細胞TLR3、7、8和9 mRNA在12小時時表達已開始增加，除T細胞的TLR7 mRNA表達在48小時時略有下降外，其余表達基本一直持續增加，至48小時到達峰值;4.人T、B細胞在被黃芩苷作用前使用鼠抗人TLR4單克隆抗體封閉，會顯著降低黃芩苷對TLR3、7、8和9 mRNA表達的誘導作用(P＜0.05)，T 細胞下降比率分別為 47.6%、66.7%、50.9% 和 45.5%;B 細胞下降比率分別為 50.0%、45.0%、50.8% 和 50.8%。結論:1.黃芩苷在體外能顯著促進T、B淋巴細胞增殖;2.人外周血T、B細胞組成性表達含量差異較大的TLR1-10 mRNA，黃芩苷在體外可以顯著上調人 T、B 淋巴細胞 TLR3、TLR7、TLR8及 TLR9 mRNAs的表達，但對 TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6及TLR10 mRNAs未見明顯影響;3.黃芩苷可能通過TLR4發揮對人天然免疫能力的調節。

黃芩苷;T淋巴細胞;B淋巴細胞;Toll樣受體;RT-PCR

隨著全球疾病譜和醫療模式改變，合成藥所帶來的不良反應，利用中藥、天然藥物治療、預防疾病成了人們的追求。黃芩為唇形科植物黃芩的干燥根，主要成分以黃芩苷為主，是一種相當古老的中藥，在我國已使用了上千年，安全無害，最早記載在《神農本草經》中并列為中品。近年來，國內外對其進行了大量的研究，且達到了較高的水平，其中較大比例的研究是黃芩中有效成分黃酮類化合物，并從多個角度進行了探討，已有很多文獻報道黃芩苷在體外具有很好的抗真菌感染和抗腫瘤等作用[1]，但尚未報道黃芩苷免疫調節及受體研究。

宿主的防御機制包括非特異性免疫和特異性免疫，Toll樣受體(TLR)廣泛表達在天然免疫系統，是一類Ⅰ型跨膜糖蛋白，由胞外區、跨膜區和胞質區組成。它們通過識別保守的病原體相關的分子位點(PAMPS)，例如細菌的脂多糖、脂肽，或者是細菌和病毒的 DNA、RNA等，來識別大量的異己抗原。TLRs在固有免疫和引導適應性免疫中扮演著重要的角色，國內外均有不少關于TLRs的報道。

本研究擬通過黃芩苷在體外對人T、B淋巴細胞Toll樣受體表達的影響，探討該藥物可能作用的位點，為黃芩苷的進一步廣泛應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和抗體 黃芩苷由江西省中藥研究所提供，純度達99.9%。新鮮人血購自江西省血站。DMEM、TRIzol試劑購自Transgen公司。UCG、cDNA第一鏈合成試劑盒購自 Fermentas公司。SYBR Green實時定量PCR試劑盒購自Tiangen公司。鼠抗人TLR4、CD3單克隆抗體購自eBioscience公司。流式細胞分析使用儀器配套試劑。淋巴細胞分離液購自天津中科院。SPA和ConA購自Sigma公司。RPMI1640購自美國Gibco公司。

1.2 制備高純度和高活性的T、B細胞

1.2.1 尼龍毛柱的制備 尼龍毛用0.2 mol/L鹽酸浸濕數小時，后用雙蒸水沖洗3遍。再將尼龍毛置入燒杯中，加雙蒸水煮沸10分鐘，將尼龍毛置漏斗內滴干。重復上述過程6次，最后兩次用去離子水。稱取尼龍毛5克，將其仔細撕開，梳整，使其松散均勻，裝入50 ml注射器內，高壓滅菌。將柱內尼龍毛用預溫的RPMI1640浸潤，關閉閥門。37℃靜止30分鐘。用Hank液和RPMI1640細胞培養基各5 ml洗柱，流速 0.2 ml/s。

1.2.2 人外周血淋巴細胞的分離 靜脈血用pH7.2～7.6的Hank液2倍稀釋，加入到等量淋巴細胞分離液面上，用水平離心機以2 000 r/min離心30分鐘，收獲單個核細胞，采用貼壁法去除單核細胞，最后獲得淋巴細胞備用。

1.2.3 T、B淋巴細胞分離 將細胞懸液裝入尼龍毛柱，關閉閥門，置37℃孵育60分鐘。然后用37℃預溫20%FCS RPMI1640培養液40 ml洗脫柱2次，流速1滴/秒;洗脫液中富含T細胞;將裝載尼龍毛柱的注射器放置4℃冰箱30分鐘，再用玻棒輕輕擠壓尼龍毛柱，再用預冷的RPMI1640培養液反復沖洗擠壓幾次，這樣收集的液體中富含B細胞;對分離的 T、B細胞用 CDC鑒定純度(＞90%)，用0.25%臺盼藍染色，鑒定活性(＞95%);調整細胞濃度為1×107ml-1備用。

1.3 采用UF-50流式分析尋找最佳的黃芩苷作用濃度

1.3.1 將黃芩苷配成8 mg/ml溶液，再倍比稀釋，制成4、2、1和 0.5 mg/ml的黃芩苷溶液，分別取 1 ml與制備好的1 ml細胞懸液混合，同時設置陰性和陽性對照，置于CO2溫箱孵育48小時。

1.3.2 UF-50開機自檢通過后，將黃芩苷和細胞作用的溶液輕輕混勻后，上機測試，結果以散點圖表示，根據散點圖判斷黃芩苷最佳作用濃度。

1.4 采用實時定量熒光RT-PCR分析在最佳黃芩苷作用濃度處理前后TLRs的表達情況

1.4.1 將黃芩苷最佳作用濃度處理的細胞用RNA提取和逆轉錄試劑盒制成cDNA備用，同時設置陰性對照。

1.4.2 結合文獻和自己設計TLRs受體及β-actin的引物備用(見表1)。

1.4.3 實時定量熒光 RT-PCR使用25 μl體系: 12.5 μl的 2 × SYBR Green PCR Master Mix，1 μl的cDNA，引物的終濃度為 0.3 μmol/L，余量用蒸餾水補足。反應條件:95℃15分鐘，接著是40個循環: 95℃變性15秒，58℃退火15秒，72℃延伸30秒。

1.4.4 采用相對定量標準曲線法進行定量，以βactin標準化加入的樣本量，最終結果表示為經藥物處理前后基因表達的差異。

1.5 通過受體抑制實驗應用實時定量熒光 RTPCR探討黃芩苷對TLRs的調節機制

1.5.1 根據文獻和已經了解的TLRs識別的位點，設計受體抑制實驗。

1.5.2 按照抗體試劑盒說明書將抗體和制備好的細胞懸液在4℃作用30分鐘后，再用最佳濃度黃芩苷處理，然后用RNA提取和逆轉錄試劑盒制成cDNA備用，同時設置抗體陰性對照。

1.5.3 同 1.4.3。

1.5.4 定量方法同 1.4.4。

1.5.5 根據抗體加入與否，TLRs表達的差異，探討黃芩苷對TLRs的調節位點。

2 結果

2.1 流式分析確定最佳黃芩苷作用濃度 細胞流式分析結果見圖1、2及表2:從散點圖、細胞計數和統計分析的結果可發現低濃度黃芩苷對T、B細胞增殖有促進作用，1 mg/ml黃芩苷為最佳濃度，而高濃度黃芩苷對T、B細胞有一定毒性。

2.2 熒光定量RT-PCR的熔解曲線和擴增曲線直接對未經黃芩苷處理的 T、B細胞進行 TLR1-TLR10表達的熒光定量RT-PCR分析，其熔解曲線和擴增曲線見圖3、4，可以觀察到在75℃至85℃之間存在特異性的峰，證明PCR反應存在特異性的擴增產物，擴增曲線平滑，具有較典型的S形，證明PCR反應體系設計合理，結果可靠。也表明人T、B細胞組成性的表達含量差異較大的TLR1-TLR10 mRNA。

表1 引物列表Tab.1 Primer list

圖1 流式分析散點圖(n=5)Fig.1 Streaming scatterplot chart analysis(n=5)

表2 不同濃度黃芩苷對淋巴細胞轉化影響的結果(x ± s，n=5，個/μl)Tab.2 The lymphocyte transformation effect by different concentrations of baicalin(x ±s，n=5，/μl)

圖2 不同濃度黃芩苷對淋巴細胞轉化影響的結果(x ± s，n=5，個/μl)Fig.2 The lymphocyte transformation effect by different concentrations of baicalin(x ±s，n=5，/μl)

圖3 熔解曲線Fig.3 Melted curve

2.3 黃芩苷對人T、B細胞TLR1-TLR10 mRNA表達的影響 圖5顯示了人T、B細胞經黃芩苷處理后TLR1-TLR10 mRNA表達量相對于基礎表達量的比值。1 mg/ml黃芩苷能顯著上調人T、B細胞表面TLR3、7、8、和9 mRNA 表達量(P ＜0.05)，但是對其他TLRs mRNA表達無影響。

圖4 擴增曲線Fig.4 Amplification curve

圖5 黃芩苷對TLRs mRNA表達的調節Fig.5 The adjustment of the TLRs mRNA expression by baicalin

2.4 不同黃芩苷作用時間對人T、B細胞TLR3、7、8和9 mRNA表達的影響 從圖6和7中可以發現在黃芩苷作用下人T、B細胞TLR3、7、8和9 mRNA在12小時時表達已開始增加，除T細胞的TLR7 mRNA表達在48小時時略有下降外，其余表達基本一直持續增加，至48小時到達峰值。

2.5 抗TLR4單克隆抗體對黃芩苷作用人T、B細胞TLR3、7、8和9 mRNA表達的抑制 人T、B細胞在被黃芩苷作用前使用鼠抗人TLR4單克隆抗體封閉，會顯著降低黃芩苷對TLR3、7、8和9 mRNA表

圖6 不同黃芩苷作用時間對T細胞TLR3、7、8和9 mRNA表達的影響(n=3)Fig.6 The influence of T cell’s TLR3，7，8 and 9 mRNA expression by different baicilin effect time(n=3)

圖7 不同黃芩苷作用時間對B細胞TLR3、7、8和9 mRNA表達的影響(n=3)Fig.7 The influence of B cell’s TLR3，7，8 and 9 mRNA expression by different baicilin effect time(n=3)

達的誘導作用(P＜0.05)，如圖8和9所示。

3 討論

TLRs家族主要分布于免疫細胞以及同外界相通的腔道上皮細胞表面，在巨噬細胞和樹突狀細胞等專職抗原提呈細胞表面的表達尤其豐富。TLRs對于外源性配體和內源性配體的識別作用無論在固有免疫和獲得性免疫中都起關鍵作用。在系統性紅斑(SLE)的病人中，TLR7和TLR9在活化自身反應性B細胞中扮演重要角色，活化的B細胞再通過分泌自身抗體、活化自身反應性T細胞和分泌細胞因子來加速SLE疾病進程，在這個包括B細胞、T細胞、樹突狀細胞和可溶性介質組成的正反饋網絡中，TLRs發揮著主要作用[2]。

本研究揭示了黃芩苷能誘導人T、B細胞上調TLR3、7、8和9 mRNA的表達，并且這種上調可以部分被鼠抗人TLR4單克隆抗體抑制，提示黃芩苷可以通過調節TLRs的表達影響天然免疫。

圖8 T細胞在抗體封閉前后差異(*.P＜0.05，n=5)Fig.8 The difference of T cell before and after withantibody closed(* .P ＜0.05，n=5)

圖9 B細胞在抗體封閉前后差異(*.P＜0.05，n=5)Fig.9 The difference of B cell before and after with antibody closed(* .P ＜0.05，n=5)

TLR3、TLR7、TLR8和TLR9識別的病原體相關的分子位點(PAMPS)是病毒和細菌的核酸，TLR3識別在大多數病毒感染過程中產生的雙鏈RNA，TLR9識別細菌DNA所特有的非甲基化DNA二核苷酸—CPG，TLR7和TLR8可以識別單鏈RNA，并且TLR7和TLR8還可以識別小分子干擾RNA(siRNA)。通過給卵清蛋白致敏的小鼠注射 TLR2、TLR3、TLR4、TLR7和TLR9增強劑，發現激活TLR7和TLR9后能有效降低氣道過敏反應，尤其是激活TLR7的作用更加顯著[3]。TLR信號傳導能調節人類骨髓細胞的發育，人類骨髓CD34+祖細胞可以持續表達功能性的TLR8和TLR9，TLR8和TLR9的配體能誘導白細胞生成，而不產生任何外源性的細胞因子[4]。在正常情況下，對TLR刺激會引起免疫系統各種細胞的活化，能引起和增強保護性的Th1型免疫應答，然而在某些易感基因的遺傳背景下，TLR的刺激可以誘導自身免疫病，在對系統性紅斑狼瘡模型小鼠的研究中發現，TLR9缺失會導致自身抗體從抗核抗體向TLR7依賴的抗核糖體抗體IgG2a和IgG2b轉變，加快了疾病進程和致死性，因此TLR的信號傳導不僅能誘導自身免疫，而且能調節耐受[5]。

同樣在對患狼瘡的小鼠研究中，發現TLR9的缺失會加重病情，而 TLR-7的缺失卻會改善病情[6]。這些結果給了我們在自身免疫病中可采用TLR直接治療的重要提示。通過對TLR7主鏈上腺嘌呤的置換，可以誘導產生調節性細胞因子，使變應原特異性Th2細胞向Th1/Th0型轉換，合適的修改就可以作為治療變態反應性疾病的免疫療法的有效佐劑[7]。TLR9的胞內定位對于它的自身-非自身的DNA識別非常重要，但是其機制還不清楚，我們發現TLR9的跨膜區指向CD25，也是一種Ⅰ型跨膜蛋白，其胞內隔間包含TLR9，我們還發現TLR9是和TLR3共定位的，雖然不是通過TLR3的跨膜區，而是TLR3的胞內定位區，這些數據表明TLR9的跨膜區是重要的調節因素，直接指向TLR9的胞內定位[8]。有研究已證實 TLR2、TLR4、TLR9 可能與類風濕關節炎(RA)的發病有關[9]。TLR3、TLR4配體和TLR7、TLR8配體對某些細胞因子如IFN的基因表達有協同刺激作用[10]。

由此推測黃芩苷同時對 TLR3、TLR7、TLR8和TLR9 mRNA表達的上調有可能提高人的抗病毒、抗感染的能力，亦可能對于自身免疫病及變態反應存在一定作用。不過值得注意的是，黃芩苷的上調幅度比較大，需要控制好劑量，避免易感性增加所帶來的不利影響。

在抗原依賴或非依賴應答中，T細胞表達的TLRs對于保存和活化長壽命記憶T細胞有一定作用[11]，近期有證據表明TLR信號對于影響未致敏T細胞向Th1或Th2型應答轉化非常重要，同時也直接或間接的影響調節性T細胞的功能[12]，調節性T細胞在維持外周耐受、限制過度免疫應答對組織的損傷和腫瘤的免疫治療等多方面發揮作用，B細胞的增殖、分化和抗體的類別轉化都和TLRs存在聯系[13]，有研究表明在慢性丙肝患者的治療中可以發現TLR2、TLR4和 TLR9表達的增加[14]。黃芩苷對人T、B細胞TLRs表達的調節可以證實其間接參與抗炎、抗腫瘤和免疫調節等作用。

黃芩苷是一種黃酮類的糖綴物，我們的研究結果表明它同靈芝多糖一樣可以通過TLR4發揮調節作用[15]，從受體抑制實驗的結果分析，TLR4抑制后黃芩苷誘導的TLR3、7、8和9 mRNA的上調幅度下降50%左右，證明TLR4是黃芩苷的主要作用位點。

綜上，黃芩苷不僅僅是單純調節T、B細胞TLRs mRNA的表達變化，而是通過對TLKs表達的調節間接參與抗炎、抗腫瘤和免疫調節作用，在固有免疫和引導適應性免疫中扮演著重要的角色，更詳細的機制我們將繼續深入研究。

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[收稿2012-03-21 修回2012-05-08]
(編輯 張曉舟)

Regulation of baicalin on TLRs of the lymphocytes in human

SUN Wu，XIONG Ying，WANG Min，JIANG Qing-Long，GONG Shu-Qi，FU Ying-Yuan.The Immune Laboratory of Medical College of Nanchang University，Nanchang 330000，China

Objective:To study the effect of baicalin on TLRs of the lymphocyte and function of immune regulation.Methods1.After T and B lymphoytes were separated by nylon wool cotton column，we used UF-50 to test the optimum concentrations of baicalin to the proliferation of T，B lymphocytes.2.The different expression of TLRs mRNA before procession and after procession was analyzed by the real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction.3.The regulation point of baicalin for TLRs was studied by the receptor inhibition test using monoclonal antibodies rat against human TLR4 and the real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction.Results1.Baicalin could significantly promote the proliferation of T and B lymphocytes of human in vitro at the concentration of 1 mg/ml(P ＜0.05);2.The mRNA of TLR3，TLR7，TLR8 and TLR9 on the lymphocyte was up-regulate by 1 mg/ml baicalin in vitro(P ＜0.05)，the increased fold was 21，15，57 and 66 respectively in T lymphocytes，the increased fold was 24，20，61 and 63 respectively in T lymphocytes;3.The expression of mRNA of TLR3，TLR7，TLR8 and TLR9 on the T，B lymphocytes began to increase at 12 h，and kept increasing，nearly reached peak levels at 48 h，except TLR7 mRNA of T lymphocytes decreased slightly at 48 h;4.When T and B lymphocytes was inhibited by using monoclonal antibodies rat against human TLR4 before treated by baicalin，the up-regulation of mRNA of TLR3，TLR7，TLR8 and TLR9 was significantly decreased(P ＜ 0.05)，which made the decrease rate was 47.6%，66.7%，50.9%，45.5%respectively in T lymphocytes and the decrease rate was 50.0%，45.0%，50.8%，50.8%respectively in B lymphocytes.Conclusion1.To confirm that baicalin could significantly promote the proliferation of T and B lymphocytes of human in vitro;2.To confirm that T and B lymphocytes constitutively expressed different quantity of mRNAs for TLR1-10，the expression of mRNA of TLR3，TLR7，TLR8 and TLR9 on the lymphocyte was significantly up-regulate by baicalin in vitro，but baicalin had no influence for other TLRs;3.To confirm that Baicalin may regulate innate immunity of human through TLR4.

Baicalin;T lymphocyte;B lymphocyte;TLR;RT-PCR

R363

A

1000-484X(2012)08-0706-06

10.3969/j.issn.1000-484X.2012.08.007

①本文為江西省自然科學基金資助項目(No.2007GZY0991)

②九江市第一人民醫院檢驗科，九江 332000

孫 午(1974年-)，男，醫學碩士，副主任技師，主要從事抗感染免疫方面的研究，E-mail:sunwujj@163.com;

及指導教師:傅穎媛(1953年-)，女，教授，主要從事免疫學方面的研究，E-mail:hqfyy@126.com。

·臨床實驗免疫學·