應用雞胚活體電轉GFP示蹤技術觀察脊髓左右兩側神經元纖維投射①

楊慈清 石曉衛 胡阿珍 賈陽陽 郭志坤 林俊堂 (新鄉醫學院生命科學技術系，新鄉453003)

應用雞胚活體電轉GFP示蹤技術觀察脊髓左右兩側神經元纖維投射①

楊慈清 石曉衛 胡阿珍②賈陽陽②郭志坤②林俊堂 (新鄉醫學院生命科學技術系，新鄉453003)

目的:探索雞胚發育過程中，脊髓左右側神經元經纖維之間的聯系，為脊髓兩側神經纖維投射提供形態學基礎;方法:采用雞胚帶殼開窗培養技術，待胚胎發育至第3天，通過活體電轉基因，將pCAGGS-GFP質粒0.1～0.5 μl準確注射到脊柱，在電壓18 V、每次脈沖60 ms，間隔100 ms，電脈沖6次的條件下進行定時定位活體電轉基因，電轉后6小時開始到10天，分別收集胚胎，甲醛固定冰凍切片，DAPI染細胞核觀察組織形態結構變化。結果:電轉后6小時便可以觀察到GFP的表達，24小時后可以看到GFP標記細胞纖維的投射，3天可以清晰的觀察到轉入GFP一側脊髓的運動神經元纖維束投射到另外一側脊髓。結論:電轉GFP成功標記運動神經元纖維在脊髓左右兩側的投射。

雞胚;胚胎發育;活體電轉;纖維投射

脊椎動物胚胎發育是一個非常復雜的過程，而神經系統的發育較其他系統要早，神經系統來源于神經外胚層，由神經管和神經嵴分化而來，在早期胚胎發育過程中，神經嵴是周圍神經系統的原基，神經管是中樞神經的原基，神經管的頭段分化為腦，尾段分化為脊髓。如果神經管沒有完全閉合就會引起多種類型先天畸形，如脊柱裂、腦裂等。在神經管不同的部位存在不同的神經細胞，如神經管側板背側的成神經細胞分化為感覺神經元，而運動神經元由側板腹側成神經細胞分化而來[1]。在中樞神經系統中，神經元纖維存在交互作用[2，3]，Lodin[4]在雞胚背根神經節組織培養過程中觀察到軸-軸或軸-體突觸。腦中不同神經元具有不同的功能，目前，對其神經纖維的投射研究較多[5，6]，但對于脊髓中神經纖維的投射研究較少，尤其是胚胎發育過程，楊琳等[7]曾以成年大鼠作為動物模型，應用辣根過氧化物酶逆行標記左右側脊神經節間纖維的聯系。本研究以雞胚為動物模型，采用活體原位電轉GFP技術，利用GFP蛋白自發熒光的特點，研究胚胎發育過程脊髓左右兩側神經元纖維的投射，為脊髓兩側神經纖維的聯系提供形態學證據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 pCAGGS-GFP(綠色熒光蛋白)質粒由Redies博士饋贈，本實驗室擴繁提取;一抗mouse anti Neurofilament單克隆抗體(武漢博士德);二抗Goat anti mouse Cy3標記(中杉金橋);Mounting Medium with DAPI(中杉金橋);質粒DNA大量提取試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司);種雞蛋(本地種雞場);CUY-21(BEX)型多功能活體電轉儀(日本NEPA公司);M205FA型倒置體視熒光顯微鏡(德國Leica公司);Nikon ECLIPSE 80i熒光顯微鏡(日本Nikon);CM1850冰凍切片機(德國Leica)。

1.2 方法

1.2.1 原位電轉基因方法 轉染具體過程，雞胚帶殼開窗培養，待胚胎發育到第3天，取出雞胚，側面開口2～3 cm直徑大小，在體視顯微鏡下，使用毛細管注射針，將 2 μg/μl的 pCAGGS-GFP 質粒 0.1 ～0.5 μl準確注射到脊髓腔，用針狀電極置脊椎兩側，確保電極與組織之間有一定空隙，使用電轉儀進行電轉，電轉電壓18V，每次電擊60 ms，間隔100 ms，電脈沖6次，整個過程在無菌操作工作臺內完成，轉染后分別在6、12、24、48、72 小時和第10 天各取出 3 個轉染胚胎，在倒置體視熒光顯微鏡下觀察結果，電轉部位呈現綠色熒光者(綠色熒光蛋白GFP顏色)視為陽性。1.2.2 取材及切片 倒置體視熒光顯微鏡下觀察陽性表達的胚胎，在體視顯微鏡下，采用尖頭鑷子劃破卵黃膜，取出整個胚胎，轉移至4℃預冷處理的PBS液漂洗2～3次，置于4%PFA(多聚甲醛)中，置保溫盒冰塊中搖床搖晃過夜，取出組織，吸干液體，轉移到18%蔗糖溶液置冰盒中搖晃過夜，等組織沉淀到管底時取出組織吸干液體，根據組織大小，用錫箔紙做好模型，用OCT包埋，注意方向，頭朝上，確定好位置，置于液氮中冷凍后放－80℃冰箱保存，切片時取出已包埋的組織，在冰凍切片機上連續切片，一次5～10張載玻片，每張片子根據組織大小循環貼2～3行，5～10列，切片后置烤片機37℃烤片30分鐘以上，置 －80℃冰箱保存備用。

1.2.3 熒光免疫組織化學染色 從－80℃低溫冰箱中取出的冰凍切片40℃干燥20分鐘，4%PFA中4℃固定15分鐘，用1×TBS清洗三次，每次5分鐘，在含0.1%Triton X-100的1×TBS中再孵育5分鐘。每張載玻片上加1 ml免疫組化封閉液，濕盒中孵育1小時。去除封閉液后每張載玻片加300 μl經用封閉液稀釋的合適濃度Mouse anti Neurofilament(1∶300)一抗，對照組一抗稀釋液中不加抗體，4℃孵育過夜后，1×TBS清洗三次，每次5分鐘，然后每張片加300 μl用封閉液稀釋的用Cy3標記的Goat anti mouse二抗，室溫孵育1小時后，用1×TBS清洗三次，每次5分鐘。最后滴加DAPI封片劑染色10分鐘，加蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.4 圖像處理分析 用Photoshop CS3軟件處理圖片，可將兩種染色同位疊加在一起，從而分析不同蛋白質的表達定位。

2 結果

2.1 脊髓左右兩側神經元纖維投射 脊髓活體電轉能夠實現基因的定時和定位轉染，在轉染過程中能夠準確的轉染到一側脊髓(如圖1所示)，而另外一側可以直接作為對照組，在轉染過程中，很好的控制GFP只轉染到一側的脊髓神經元內，在本實驗中，利用其單側轉染特點，進行神經元遷移和纖維投射的研究。在實現定位轉染的基礎上，根據轉染時間的不同可以觀察被標記神經元的遷移及神經纖維的投射狀況，轉染后6小時便可以觀察到GFP的表達(圖1A)，24小時可以觀察到被標記神經元纖維投射現象(圖1B)，隨著時間的延長，投射現象的標記更加清晰，相對隨著時間的延長，熒光表達強度有所降低，而將胚胎培養到第10天即3天轉染GFP后7天時，組織切片在另外一側也可以看到少量神經元細胞內表達GFP(圖1F、G星號)。圖(1D、G)中可以看到，在脊神經節中有表達綠色熒光蛋白的細胞，提示，脊神經節細胞具有向對側遷移的機制。

2.2 NF及GFP雙標 在胚胎發育第3天活體電轉5天后GFP仍呈強表達(圖2A～C)，組織切片可以清晰的觀察到表達的胞體和纖維結構(圖2E、I)，從圖中(圖2E、I)可以看到，脊髓腹側中間運動神經元(Medial motor neuron column)纖維跨越底板(Floor plate)下方的腹側白質(Ventral white column)區到達對側脊髓的側白質區。作為神經骨架蛋白的指標NF(Neurofilament)主要表達在神經纖維，對其標記可以反映出神經元生長的狀態。從圖中(圖2F、J)可以看出，與對照組(圖2F)相比，實驗組(圖2J)中箭頭所示為NF陽性表達結果，從疊加圖(圖2K)可以清晰的看出，NF表達部位與GFP表達的部位吻合，屬于同一神經纖維內表達的蛋白。

圖1 雞胚胎發育過程脊髓兩側纖維投射Fig.1 The projection of neuron fiber in spinal cord both side during the development of chick embryo

圖2 轉入GFP雞胚NF表達Fig.2 The expression of neurofilament in chicken embryos after in vivo electroporation with pCAGGS-GFP

3 討論

細胞示蹤技術是跟蹤細胞遷移和神經纖維投射最常用的方法，目前，示蹤技術多用生物素葡聚糖胺或辣根過氧化物酶進行局部注射跟蹤，最后通過顯色劑顯色，便可以觀察到細胞從特定位置遷移途徑或纖維投射的方向。而綠色熒光蛋白GFP是近年來廣泛使用的報告基因表達蛋白，其特點是不需要特殊的染色或顯色劑顯色，在熒光顯微鏡下便可以發出綠色熒光，與其他生物素化或酶標記的底物相比，觀察更為方便，定位準確，無毒副作用等，隨著活體電轉基因技術的發展，GFP被作為活體內電轉基因過程中的報告基因被廣泛使用，可以將目的基因與GFP構建成融合基因，通過載體上共用啟動子共同轉錄表達，或在同一種表達載體上，通過不同啟動子轉錄表達，也可以將目的基因與GFP共轉染，通過GFP可以確定目的基因表達狀況，進一步檢測。通過前期的實驗已經證明，GFP的表達并不影響雞胚胎發育及相關蛋白的表達，可以作為活體基因轉染中的報告基因，在本實驗中利用活體原位電轉基因技術，在實現定時定位和定向轉染的基礎上，對脊髓左右側神經元纖維投射的聯系進行示蹤，從結果中可以看到，由于電轉過程，質粒帶負電荷會向電場的正極進行移動，在電脈沖情況下，細胞膜通透性會變化，瞬時進入細胞內，利用表達載體自身的系統進行蛋白質的合成，示蹤效果明顯，能夠很直觀的觀察到神經元和神經纖維的投射。

在實驗過程中，也對轉染后不同時間的胚胎取材，觀察示蹤結果，從結果中看出，pCAGGS-GFP質粒轉染后6小時便會觀察到GFP的表達，24小時時會看到神經纖維中GFP的表達，根據熒光可以看出纖維投射的方向，這種結果在48小時后更為清楚，但隨著時間的延長GFP的表達會減弱，在胚胎發育的第10天即轉入GFP質粒7天后觀察時，發現熒光強度不是很強，但纖維的聯系非常清楚，除纖維聯系外，可以觀察到少量細胞向對側遷移，即說明在脊髓兩側進行著必要的聯系。劉娜等[8]在成年大鼠上采用生物素化葡聚糖胺逆行標記技術研究結果證明，一側背根節神經元纖維可到達兩側背角及背外側束，左右側脊神經節間的聯系纖維走行的位置可能主要位于中央管后方，且與后連合核有關，在本研究中主要選擇早期雞胚胎發育過程，根據GFP表達可以看出，脊神經節細胞可以從一側遷移至對側，中間運動神經元纖維經腹側白質到達對側，而側運動神經元纖維向下角外投射，提示中間運動神經元與對側存在必要聯系，側運動神經元纖維通過神經節間隙聯系到脊髓外組織。

實驗中對神經絲蛋白進行標記，神經絲蛋白是神經細胞的骨架蛋白，為大直徑有髓軸突含量最高的成分，是反映神經元功能狀況的內在標志物[9]。免疫組織化學染色檢測NF可以較靈敏地反映神經軸突的形態變化。NF是構成神經元胞體和神經軸突細胞骨架的主要成分，在維護神經元的功能和軸漿轉運等一系列與脊髓損傷修復相關的病理生理變化中發揮著重要作用。故NF作為神經骨架蛋白的指標，可提示神經元生長的狀態[10]。在結果中看到，NF表達與GFP在纖維中的表達部位重疊，提示GFP也是在細胞骨架中，根據其能夠明顯的標記出細胞骨架結構，同時也能夠清晰觀察到纖維結構，本研究只局限于胚胎發育過程中的纖維投射，對于成體纖維投射還待于進一步研究。

1 孔衛國，吳曉牧，張昆南et al.誘導人骨髓間充質干細胞向運動神經元分化的研究[J].江西醫學院學報，2009;49(9):1-4.

2 Xu G Y，Zhao Z Q.Cross-inhibition of mechanoreceptive inputs in dorsal root ganglia of peripheral inflammatory cats[J].Brain Res，2003;970(1-2):188-194.

3 Devor M，Wall P D.Cross-excitation in dorsal root ganglia of nerve-injured and intact rats[J].J Neurophysiol，1990;64(6):1733-1746.

4 Lodin Z，Faltin J，Booher J et al.Fiber formation and myelinization of cultivated dissociated neurons from chicken dorsal root ganglia:an electron microscopic and scanning electron microscopic study[J].Neurobiology，1973;3(2):66-87.

5 潘 劍，黃紹明，陳婷婷et al.大鼠小腦旁絨球的傳入纖維投射[J].廣西醫科大學學報，2010;27(3):368-369.

6 Lois J H，Rice C D，Yates B J.Neural circuits controlling diaphragm function in the cat revealed by transneuronal tracing[J].J Appl Physiol，2009;106(1):138-152.

7 楊 琳，劉 娜，楊連雪et al.應用辣根過氧化物酶逆行示蹤技術觀察左右側脊神經節間纖維聯系[J].中國臨床康復，2005;9 (41):32-33.

8 劉 娜，楊連雪，楊 琳et al.應用生物素化葡聚糖胺順行示蹤技術探索左右側脊神經節間纖維的聯系[J].中國臨床康復，2005; 9(41):22-24.

9 李曉捷，宋 銳，孫忠人.針刺對腦損傷仔鼠腦神經絲蛋白表達的影響[J].中國康復理論與實踐，2009;15(3):206-207.

10 Uchida K，Baba H，Maczawa Y et al.Progressive changes in neurofilament proteins and growth associated protein-43 immunoreactivities at the site of cervical spinal cord compression in spinal hyerostotic mice[J].Spine，2002;27(5):480-487.

[收稿2011-11-20 修回2012-03-16]

(編輯 倪 鵬)

Observation of projections between the left and right spinal cord neuron fibers with electroporation GFP tracing technique in vivo of chick embryo

YANG Ci-Qing，SHI Xiao-Wei，HU A-Zhen，JIA Yang-Yang，GUO Zhi-Kun，LIN Jun-Tang.Department of Life Science and Technology，Xinxiang Medical University，Xinxiang 453003，China

Objective:To explore the connection between the left and right side spinal cord neurons fiber during the development of the chick embryo，in order to provide the morphological basic information for the projection of the nerve fibers on both sides of the spinal cord.MethodspCAGGS-GFP was transformed into spinal cord of chicken embryos which was used to in ovo culture technique until the embryos developed to 3 d.The condition of in vivo electroporation was voltage 18 V，each pulse 60 ms，interval 100 ms and 6 times pulse.The embryo after electroporation from 6 hours to 10 days were collected and fixed with 4%PFA and frozen sections，nucleus was stained with DAPI.ResultsThe GFP expression was be observed at the time of 6 hours after in vivo electroporation，the projection of fiber which was labeled GFP was observed after 24 hours and three days later the spinal cord motor neuron fibers projected onto the other side of the spinal cord was clearly obserred.ConclusionIn vivo electroporation GFP successfully marked motor neuron fibers projection between the two sides of the spinal cord during the development of chick embryo.

Chick embryo;Embryo development;In vivo electroporation;Fiber projection

Q954.48

A

1000-484X(2012)08-0718-04

10.3969/j.issn.1000-484X.2012.08.010①本文為2010年國家自然科學基金(No.31000475)和2011年新鄉

醫學院重點研究領域招標課題資助項目(No.ZD2011-26)②新鄉醫學院河南省醫用組織再生重點實驗室，新鄉453003

楊慈清(1979年－)，男，在讀博士，講師，主要從事發育神經生物學研究;

及指導教師:林俊堂(1976年－)，男，博士，主要從事發育生物學方面研究，E-mail:linjuntang2002@yahoo.co.uk。

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