檢測(cè)副溶血弧菌TDH斑點(diǎn)免疫膠體金滲濾法的研究①

楊靖亞 陸曉帆 王 珍

(上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)研究院，上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海201306)

檢測(cè)副溶血弧菌TDH斑點(diǎn)免疫膠體金滲濾法的研究①

楊靖亞 陸曉帆 王 珍

(上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)研究院，上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海201306)

目的:制備特異性檢測(cè)副溶血弧菌TDH的斑點(diǎn)免疫膠體金滲濾測(cè)試盒(Dot immunogold filtration assay，DIGFA)。方法:T6D4和T9H4兩株抗體分別標(biāo)記于金顆粒和點(diǎn)樣于硝酸纖維素膜，通過(guò)雙抗體夾心法來(lái)開(kāi)發(fā)斑點(diǎn)免疫膠體金滲濾測(cè)試盒，并對(duì)測(cè)試盒的特異性、重復(fù)性、穩(wěn)定性做了分析。結(jié)果:研制的斑點(diǎn)免疫膠體金滲濾測(cè)試盒能夠特異性檢測(cè)副溶血弧菌TDH，其最低檢測(cè)限達(dá)到250 ng/ml TDH，該測(cè)試盒在4℃恒溫條件下保存12周后仍表現(xiàn)出準(zhǔn)確和穩(wěn)定的檢測(cè)結(jié)果。結(jié)論:成功制備了檢測(cè)副溶血弧菌TDH的斑點(diǎn)免疫膠體金滲濾測(cè)試盒，對(duì)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)TDH提供了可靠的測(cè)試工具。

副溶血弧菌;耐熱直接溶血毒素;斑點(diǎn)免疫膠體金滲濾法;快速檢測(cè)

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus，Vp)是一種能引起食物中毒和旅游者腹瀉的嗜鹽性細(xì)菌，目前已知的副溶血弧菌有12種O抗原及59種K抗原，據(jù)其發(fā)酵糖類(lèi)的情況可分為5個(gè)類(lèi)型。各種弧菌對(duì)人和動(dòng)物均有較強(qiáng)的毒力。食用蝦、蟹、貝類(lèi)等水產(chǎn)品所致副溶血弧菌食物中毒，起病急驟，常有腹痛、腹瀉、嘔吐、失水、畏寒及發(fā)熱。腹痛多呈陳發(fā)性絞痛，常位于上腹部、臍周或回盲部。腹瀉每日3～20余次不等，大便性狀多樣，多數(shù)為黃水樣或黃糊便。約2%～16%呈典型的血水或洗肉水樣便，部分病人的糞便可為膿血樣或粘液血樣。由于吐瀉，患者常有失水現(xiàn)象，重度失水者可伴聲啞和肌痙攣，個(gè)別病人血壓下降、面色蒼白或發(fā)紺以至意識(shí)不清。近年來(lái)副溶血弧菌引起食物中毒的發(fā)生規(guī)模以及人群暴露規(guī)模呈明顯上升趨勢(shì)，已成為我國(guó)首要的食源性致病菌[1]。目前研究顯示，副溶血弧菌的主要致病因子是其產(chǎn)生的多種溶血毒素和尿素酶，分別有不耐熱溶血毒素(Thermolabile hemolysin，TLH)、耐熱直接溶血毒素(Thermostable direct hemolysin，TDH)、直接溶血相關(guān)毒素(TDH-related hemolysin，TRH)，其中耐熱直接溶血毒素TDH是主要的致病因子[2]。TDH是一種細(xì)胞毒素，該毒素是不含糖或脂質(zhì)的蛋白質(zhì)，由165個(gè)氨基酸殘基組成，富含天門(mén)冬酸和纈氨酸。其等電點(diǎn)約為4～5之間，最小和最大吸收光譜分別為250 nm和277 nm，分子量約46 kD，由兩個(gè)相同的亞基組成[3]。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于已報(bào)道的副溶血弧菌TDH的檢測(cè)方法以多重PCR技術(shù)，熒光實(shí)時(shí)PCR技術(shù)，ELISA檢測(cè)技術(shù)為主[4-6]。然而，這些方法始終擺脫不了耗時(shí)、費(fèi)力、經(jīng)濟(jì)成本等不可避免的不足之處，在很大程度上限制了對(duì)于致病性副溶血弧菌在環(huán)境現(xiàn)場(chǎng)以及臨床快速預(yù)防檢測(cè)的實(shí)行，同時(shí)還考慮到這些方法對(duì)實(shí)驗(yàn)員的操作上要求較高和繁瑣的儀器使用，根本不能夠被廣泛地運(yùn)用于基層單位的檢測(cè)應(yīng)用、不能夠達(dá)到真正意義的“快速”檢測(cè)效果。

免疫膠體金技術(shù)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體檢測(cè)的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)。用膠體金顆粒標(biāo)記抗體或抗原，以檢測(cè)未知抗原或抗體的方法稱(chēng)免疫膠體金技術(shù)。她不僅具備了免疫學(xué)中抗原與抗體特異性結(jié)合的特點(diǎn)，同時(shí)還可以通過(guò)金顆粒聚集后的顯色反應(yīng)，最終能夠快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出目的物，從采樣到獲得結(jié)果大約只需要10～15分鐘左右[7，8]，從而完全滿(mǎn)足副溶血弧菌TDH快速和操作簡(jiǎn)單的檢測(cè)要求。

然而，國(guó)內(nèi)外對(duì)于斑點(diǎn)免疫膠體金滲濾檢測(cè)法用于TDH的檢測(cè)未曾報(bào)道。因此，本文以期通過(guò)雙抗體夾心檢測(cè)原理結(jié)合于斑點(diǎn)免疫膠體金滲濾法，首次制備特異性針對(duì)副溶血弧菌TDH的快速檢測(cè)試劑盒，實(shí)現(xiàn)能夠滿(mǎn)足于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的要求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 硝化纖維膜NC購(gòu)于Whatman公司;TDH由本實(shí)驗(yàn)室制備所得;TDH單克隆抗體均由本實(shí)驗(yàn)室制備所得;牛血清白蛋白BSA、四氯金酸HAuCl4、檸檬酸三鈉購(gòu)置于Sigma公司;致病性副溶血弧菌ATCC33846(標(biāo)準(zhǔn)菌株)購(gòu)于北京中原公司;沙門(mén)氏菌、大腸桿菌、單核細(xì)胞增多性李斯特菌、金黃色葡萄球菌、非致病性副溶血弧菌F188(從南美白對(duì)蝦分離出，只含TLH不含TDH，通過(guò)生理生化試驗(yàn)和PCR分析，確定為非致病性副溶血弧菌)菌株均由上海海洋大學(xué)食品安全實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng);所有的化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 TDH的制備 37℃條件下對(duì)致病性副溶血弧菌ATCC 33846進(jìn)行搖床擴(kuò)大培養(yǎng)16小時(shí)，8 000 r/min離心取上清去掉菌體，硫酸銨鹽析提取粗蛋白，然后依次經(jīng)過(guò) DEAE-纖維素、DEAE-Sephadex A-50、葡聚糖G-75層析純化TDH，冷凍干燥純化后的 TDH[9]，準(zhǔn)確稱(chēng)量，溶解于少量 pH7.4，0.01 mol/L的PBS中。

1.2.2 膠體金顆粒的制備 一株抗TDH單克隆抗體T6D4由實(shí)驗(yàn)室制備所得，膠體金顆粒的制備過(guò)程根據(jù)文獻(xiàn)[10]所報(bào)道。首先，將盛有 100 ml 0.01%HAuCl4的燒杯置于恒溫磁力攪拌器徹底煮沸;隨之迅速加入1.7 ml新鮮配制的1% 檸檬酸三鈉;在不斷的攪拌中繼續(xù)加熱煮沸;待液體顏色轉(zhuǎn)變?yōu)榫萍t色后，追加煮沸5分鐘即可。最后制備所得膠體金溶液收集與棕色玻璃瓶，并保存在4℃冰箱中。膠體金顆粒大小通過(guò)紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 膠體金顆粒與待標(biāo)記抗體的標(biāo)記 對(duì)于膠體金顆粒與單克隆抗體的結(jié)合，單克隆抗體主要通過(guò)范德華力和疏水作用吸附于金顆粒表面[11]。在膠體金溶液中，金顆粒之間保持著靜電排斥與范德華引力的平衡狀態(tài)，然而一旦受到外界離子物質(zhì)的干擾后，其平穩(wěn)體系將隨之破壞，范德華引力便會(huì)大大強(qiáng)于靜電排斥力，因此顆粒間將會(huì)發(fā)生聚集反應(yīng)，溶液也會(huì)有紅色轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)色以至灰色。若當(dāng)膠體金溶液中金顆粒伴隨著一定含量蛋白分子的吸附，此平衡不會(huì)被破壞，換言之，單克隆抗體將阻止該不穩(wěn)定狀態(tài)[12]，所以為了尋找最強(qiáng)的金顆粒與單克隆抗體的結(jié)合力，我們必須挑選出最佳的pH與抗體標(biāo)記量。

最佳標(biāo)記pH選擇:通過(guò)0.1 mol/L K2CO3對(duì)膠體金溶液進(jìn)行 pH 調(diào)整，設(shè)置了 pH6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0 的不同梯度;分別取不同的 pH 膠體金溶液各1 ml于試管中，每管中均加入10 μl 1 mg/ml的TDH單克隆抗體T6D4，充分混勻后室溫靜置30分鐘;最后通過(guò)每管添加100 μl 10%NaCl (w/v)，根據(jù)溶液顏色的變化程度選出最佳標(biāo)記pH，即膠體金溶液仍將保持為酒紅色。

最佳標(biāo)記單克隆抗體量的選擇:通過(guò)0.1 mol/ L K2CO3對(duì)膠體金溶液進(jìn)行最佳標(biāo)記pH調(diào)整，取出1 ml膠體金溶液于各個(gè)玻璃試管中;每試管膠體金溶液中分別加入 0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 μl 1 mg/ml的待標(biāo)記TDH單克隆抗體T6D4;充分混勻后室溫靜置30分鐘;最后通過(guò)每管添加100 μl 10%NaCl(w/v)，根據(jù)溶液顏色的變化程度選出最佳抗體標(biāo)記量，即膠體金溶液仍將保持為酒紅色。

膠體金-抗體復(fù)合溶液的制備:本文對(duì)10 ml制備的膠體金溶液(0.1 mol/L K2CO3調(diào)整到 pH7.4)中加入120%最佳標(biāo)記量的TDH單克隆抗體T6D4進(jìn)行標(biāo)記;在磁力攪拌器的作用下，室溫勻速攪拌60分鐘，使膠體金溶液中的金顆粒與待標(biāo)記TDH單克隆抗體T6D4充分吸附平衡;隨后向膠體金復(fù)合物溶液中加入10%BSA(w/v)使復(fù)合物溶液中BSA的終濃度為1%，并在室溫勻速條件下繼續(xù)攪拌60分鐘;然后將膠體金復(fù)合物液體13 000 r/min離心60分鐘，仔細(xì)吸去上清液，最后用1 ml 0.01 mol/L PBS(含1%BSA)保存液重懸沉淀，并于4℃條件下保存。

1.2.4 斑點(diǎn)免疫膠體金滲濾檢測(cè)盒的組裝及使用1 μl 2 mg/ml單克隆抗體T9H4點(diǎn)樣于15 mm× 15 mm面積大小的NC膜中點(diǎn)處，作為檢測(cè)TDH的檢測(cè)點(diǎn)，隨后放置于37℃恒溫條件下干燥30分鐘;之后取出NC膜浸沒(méi)在2%BSA的PBS封閉液中，在4℃條件下過(guò)夜封閉處理;然后取出用超純水漂洗3次(30秒/次);最后在室溫條件下自然晾干即可，待測(cè)試盒組裝用。整個(gè)組裝我們只需在NC膜下墊放64層抽取式面紙，用一次性塑料測(cè)試卡上下包裹即可。

對(duì)于整個(gè)檢測(cè)過(guò)程包括以下步驟:滴加20 μl pH7.4 0.01 mol/L PBS(含 1%BSA)潤(rùn)濕 NC 膜;滴加60 μl檢測(cè)樣本溶液，待滲透NC膜;滴加40 μl pH7.4 0.01 mol/L PBS(含 1%Tween-20、1% BSA)洗滌NC膜;待溶液完全滲入NC膜后，滴加60 μl膠體金-抗體復(fù)合溶液，待完全滲入;最后滴加60 μl PBS洗滌液洗滌NC膜，即完成整個(gè)檢測(cè)，耗時(shí)約為3分鐘。若最終NC膜上出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)，說(shuō)明檢測(cè)樣本中含有TDH，若無(wú)紅色斑點(diǎn)說(shuō)明樣本為陰性。

1.2.5 斑點(diǎn)免疫膠體金滲濾測(cè)試盒的特異性試驗(yàn)在37℃ 180 r/min恒定條件下，對(duì)副溶血弧菌(含TDH)、沙門(mén)氏菌、大腸桿菌、單核細(xì)胞增多性李斯特菌、金黃色葡萄球菌和非致病性副溶血弧菌F188菌株進(jìn)行液體增菌搖床培養(yǎng)24小時(shí)后，對(duì)所有菌液進(jìn)行8 000 r/min離心10分鐘，取上清液作為檢測(cè)樣本。

1.2.6 斑點(diǎn)免疫膠體金滲濾測(cè)試盒的靈敏度試驗(yàn)

用PBS將純化的TDH毒素蛋白配置成不同的濃度，用測(cè)試盒進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.7 斑點(diǎn)免疫膠體金滲濾測(cè)試盒的重復(fù)性試驗(yàn)對(duì)不同的樣本多次進(jìn)行測(cè)試，用來(lái)檢驗(yàn)滲濾檢測(cè)盒的結(jié)果重復(fù)性是否專(zhuān)一。

1.2.8 斑點(diǎn)免疫膠體金滲濾測(cè)試盒的穩(wěn)定性試驗(yàn)將組裝好的滲濾檢測(cè)盒放在37℃、4℃恒溫條件下保藏1、4、8、12和16周之后再用于檢測(cè)樣本，以期檢驗(yàn)其穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 膠體金溶液的制備與金顆粒標(biāo)記 通過(guò)檸檬酸三鈉還原法制備了膠體金溶液，通過(guò)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在700～400 nm對(duì)膠體金溶液的全波長(zhǎng)掃描，制備出了在520 nm處有最大吸收峰的金顆粒(圖1)。

通過(guò)最佳pH、標(biāo)記量的摸索，確定了最佳標(biāo)記條件為:pH7.4和4 μg TDH單克隆抗體T6D4/1ml膠體金溶液(圖2)。運(yùn)用紫外可見(jiàn)光光度計(jì)進(jìn)行了掃描驗(yàn)證，溶液在535處有最大吸收峰(圖1)。

2.2 斑點(diǎn)免疫膠體金滲濾測(cè)試盒的特異性試驗(yàn)按照制備的測(cè)試盒的操作步驟分別對(duì)ATCC33846 (含TDH)、沙門(mén)氏菌、大腸桿菌、單核細(xì)胞增多性李斯特菌、金黃色葡萄球菌和非致病性副溶血弧菌F188(含TLH、不含TDH)的上清液進(jìn)行檢測(cè)，以確定所制備的DIGFA對(duì)TDH檢測(cè)的特異性。如圖3所示，該檢測(cè)盒呈現(xiàn)出了良好的特異性檢測(cè)結(jié)果。

圖1 膠體金溶液標(biāo)記前后的紫外分光光度計(jì)波長(zhǎng)掃描Fig.1 UV-visible spectra of colloidal gold and antibodygold conjugates

圖2 最佳抗體標(biāo)記量的分析Fig.2 Optimal condition of antibody concentration for coating

圖3 斑點(diǎn)免疫膠體金滲濾測(cè)試盒的特異性分析Fig.3 The analysis of DIGFA specificity

圖4 斑點(diǎn)免疫膠體金滲濾測(cè)試盒的最低檢測(cè)限Fig.4 The lowest detection limit of DIGFA

圖5 斑點(diǎn)免疫膠體金滲濾測(cè)試盒的重復(fù)性試驗(yàn)Fig.5 The repeatability assay of DIGFA

表1 斑點(diǎn)免疫膠體金滲濾測(cè)試盒的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 The stability of DIGFA for detection

圖6 斑點(diǎn)免疫膠體金滲濾測(cè)試盒對(duì)于最低檢測(cè)限的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)Fig.6 The stability evaluation on the lowest detection limit of DIGFA

2.3 斑點(diǎn)免疫膠體金滲濾測(cè)試盒的靈敏度試驗(yàn)按照制備的測(cè)試盒的操作步驟進(jìn)行檢測(cè)，將1 mg/ ml的 TDH 檢測(cè)樣本用 pH7.4，0.01 mol/L PB 溶液梯度稀釋?zhuān)_定DIGFA的最低檢測(cè)限(圖4)為250 ng/ml TDH。

2.4 斑點(diǎn)免疫膠體金滲濾測(cè)試盒的重復(fù)性試驗(yàn)每次樣本檢測(cè)均設(shè)置了3個(gè)平行對(duì)照，結(jié)果(圖5)始終表現(xiàn)均一。

2.5 斑點(diǎn)免疫膠體金滲濾測(cè)試盒的穩(wěn)定性試驗(yàn)在4℃和37℃兩種保藏條件下，分別在保藏1、4、8、12、16周之后用于對(duì)250 ng/ml TDH的陽(yáng)性樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果穩(wěn)定性如(表1和圖6)所示，明確肯定了該檢測(cè)試劑盒最佳保存期為4℃密封條件下12周。

3 討論

副溶血弧菌耐熱直接溶血毒素TDH作為最主要的致病因子，對(duì)于廣大熱衷于海產(chǎn)品的民眾的食品安全衛(wèi)生而言直接產(chǎn)生了相當(dāng)大的負(fù)面作用。雖然，國(guó)內(nèi)已大量報(bào)道了副溶血弧菌的檢測(cè)方法其中主要有PCR檢測(cè)技術(shù)、ELISA檢測(cè)技術(shù)等。檢測(cè)時(shí)間也從6～8小時(shí)不等。Blackstone等[13]對(duì)致病性副溶血弧菌的TDH基因的設(shè)計(jì)了引物5′-AAA CAT CTG CTT TTG AGC TTCCA-3′＆5′-CTC GAA CAACAA ACA ATATCT CAT CAG-3′和 熒 光 探 針 5′-FAM-TGT CCC TTT(T)CC TGC CCCCGG-3′，建立了熒光實(shí)時(shí)PCR技術(shù)，對(duì)12種不同細(xì)菌株進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明僅含有TDH的副溶血弧菌產(chǎn)生了單個(gè)熒光信號(hào)，而不含TDH的弧菌或非弧菌菌株都無(wú)任何熒光反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)特異性強(qiáng)，靈敏度也高。竇勇等[6]以副溶血弧菌1.216 4作為抗原，免疫新西蘭兔，獲得效價(jià)為1.6×105的多克隆抗體;以此多克隆抗體作為一抗，山羊抗兔IgG-HRP作為酶標(biāo)二抗，建立副溶血弧菌的間接ELISA快速檢測(cè)法。但是，其方法的檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)不能夠滿(mǎn)足快速在環(huán)境現(xiàn)場(chǎng)的或是臨床的檢測(cè)應(yīng)用，不利于進(jìn)行基層的推廣使用。

因次，本文通過(guò)免疫學(xué)檢測(cè)原理研制了斑點(diǎn)免疫膠體金滲濾法用來(lái)專(zhuān)一性檢測(cè)TDH的快速檢測(cè)盒，總耗時(shí)僅為3分鐘。相對(duì)于目前針對(duì)TDH檢測(cè)的已報(bào)道方法而言，在檢測(cè)時(shí)間上達(dá)到了質(zhì)的飛躍，此外，選用該法在檢測(cè)試驗(yàn)中，步驟簡(jiǎn)便操作簡(jiǎn)單，不涉及任何儀器，只需通過(guò)肉眼的觀察便可得出試驗(yàn)結(jié)果。同時(shí)該試劑盒最低檢測(cè)限達(dá)到250 ng/ml TDH，還表現(xiàn)出了良好的穩(wěn)定性與重復(fù)性，并在4℃恒溫條件下保存12周后仍可以使用，無(wú)出現(xiàn)結(jié)果偏差。

目前，國(guó)內(nèi)對(duì)于檢測(cè)副溶血弧菌TDH的斑點(diǎn)免疫膠體金滲濾法開(kāi)發(fā)的尚無(wú)報(bào)道，所以本文的研制為滿(mǎn)足基層大批量在環(huán)境現(xiàn)場(chǎng)或是臨床的快速檢測(cè)上提供了可靠的工具。

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[收稿2011-11-20 修回2012-04-25]

(編輯 許四平)

Development of dot-immunogold filtration assay to detect TDH produced by Vibrio parahaemolyticus

YANG Jing-Ya，LU Xiao-Fan，WANG Zhen.Ocean Science Institution Research Institute，Shanghai Ocean University，Shanghai Engineering Center for Processing and Storage of Acquatic Product，Shanghai 201306，China

Objective:To develop a Dot immunogold filtration assay to especially detect TDH(thermostable direct hemolysin) produced by vibrio parahaemolyticus.MethodsT6D4 and T9H4 were coated to nanogold and ejected onto nitrocellulose filter membrane respectively.We developed the test kit via sandwich assay with double-antibodies，and analyzed its specificity，repeatablity and stability.ResultsThe DIGFA kit could especially detect TDH at the lowest level of 250 ng/ml.It also exhibited exact and stable testing result after 12 weeks later stored under 4℃.ConclusionThe study successfully developed the DIGFA kit，which could be widely applied into detect TDH rapidly on the scene.

Vibrio parahaemolyticus;Thermostable direct hemolysin;Dot immunogold filtration assay;Rapid detection

R392.12

A

1000-484X(2012)08-0733-05

10.3969/j.issn.1000-484X.2012.08.013①本文為上海市科委工程中心建設(shè)項(xiàng)目(11DZ2280300)及上海市教育委員會(huì)重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(J50704)

楊靖亞(1976年-)，女，博士，副教授，主要從事海洋生物資源綜合利用與海洋藥物的開(kāi)發(fā)、腫瘤藥理學(xué)方面的研究，E-mail:jyyang@shou.edu.cn。

·實(shí)用臨床免疫學(xué)·