糖皮質激素誘導的亮氨酸拉鏈蛋白(GILZ)在人氣道上皮細胞中的表達及對MAPK信號通路的影響①

劉靜月 符 州 張明香 劉恩梅 羅征秀 王莉佳

(重慶醫科大學附屬兒童醫院呼吸中心，重慶400014)

糖皮質激素誘導的亮氨酸拉鏈蛋白(GILZ)在人氣道上皮細胞中的表達及對MAPK信號通路的影響①

劉靜月②符 州 張明香 劉恩梅 羅征秀 王莉佳②

(重慶醫科大學附屬兒童醫院呼吸中心，重慶400014)

目的:探討糖皮質激素誘導的亮氨酸拉鏈蛋白(GILZ)在人氣道上皮細胞9HTE0中的表達以及對MAPK信號通路因子Raf-1、Mek1/2、Erk1/2的影響。方法:采用RT-PCR及Western blot法檢測地塞米松(Dex)作用后GILZ mRNA及蛋白的表達，同時細胞免疫熒光法檢測GILZ蛋白的定位;合成三條GILZ-SiRNA分別轉染人氣道上皮細胞9HTE0，用Q-PCR及Western blot法篩選出沉默效果最佳的一條;Western blot法檢測MAPK信號通路因子Raf-1、Mek1/2、Erk1/2磷酸化蛋白及其總蛋白的表達。結果:Dex能夠明顯刺激人氣道上皮細胞9HTE0GILZ mRNA及蛋白的表達，GILZ蛋白主要定位在細胞漿中，Dex抑制了Raf-1、Mek1/2、Erk1/2磷酸化蛋白的表達，而GILZ-SiRNA轉染后，Raf-1.Mek1/2、Erk1/2磷酸化水平有所回升。結論:糖皮質激素作為支氣管哮喘一線用藥，雖然能夠誘導GILZ表達并發揮一定的抗炎作用，但同時GILZ卻抑制了在氣道上皮修復中起重要作用的MAPK信號通路的激活，這為臨床上研究哮喘防治新措施提供了理論依據。

糖皮質激素;GILZ;氣道上皮細胞;MAPK;支氣管哮喘

糖皮質激素(Glucocorticoid，GC)是一類由腎上腺皮質分泌的甾體激素，它調節著糖、脂肪以及蛋白質的生物合成和代謝，同時還有抗過敏、抗炎以及免疫抑制的作用。在哮喘治療中GC作為一線藥物在臨床上被廣泛應用，其中糖皮質激素誘導的亮氨酸拉鏈蛋白(Glucocorticoid-induced leucine zipper，GILZ)是GC重要的抗炎介導者[1]，但同時它還能與促分裂原活化的蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族成員相互作用，抑制信號通路的磷酸化，從而抑制氣道上皮損傷后修復的過程[2，3]。在支氣管哮喘的發生發展中，氣道變化貫穿著整個病理過程，氣道上皮是外部環境與機體內環境相互作用的屏障，本研究通過地塞米松(Dexamethasone，Dex)處理人氣道上皮細胞9HTE0，觀察GILZ的表達情況及其對MAPK信號通路的影響，為臨床上進一步研究哮喘防治新措施提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 人氣道上皮細胞9HTE0(美國模式培養物保藏所，ATCC)，由重慶醫科大學附屬兒童醫院研究所呼吸研究室保存，胎牛血清、OPTI-MEM購自Gibco公司，Dex購自Sigma公司，總RNA快速提取試劑盒、BCA法蛋白定量試劑盒購自 Bioteke公司，PrimeScript RT reagent Kit購自TaKaRa公司，RealMasterMix(SYBR Green)購自天根公司，Lipofectamine 2000購自 Invitrogen公司，GILZ、β-actin、GAPDH 引物、GILZ-SiRNA 等合成自Invitrogen公司，小鼠抗人GILZ單克隆抗體購自Santa Cruz公司，兔抗人 p-Raf-1、Raf-1、p-Mek1/2、Mek1/2、p-Erk1/2、Erk1/2單克隆及多克隆抗體購自Cell Signaling Technology公司，抗β-actin鼠單克隆抗體、山羊抗小鼠DyLight488熒光二抗購自康為世紀公司，辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠/兔二抗購自聯科生物公司，全蛋白提取試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、ECL檢測試劑盒購自凱基公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 9HTE0細胞在含10%胎牛血清的DMEM培養液中37℃、5%CO2孵箱常規培養，倒置顯微鏡下定時觀察細胞生長狀態。每2～3天待細胞長滿培養瓶的80%～90%左右消化傳代。

1.2.2 RT-PCR 法檢測 GILZ mRNA 在9HTE0細胞中表達情況 將9HTE0細胞以每孔5×105個細胞鋪于6孔板中，貼壁后加入終濃度10 μmol/L Dex培養6、12、24小時，按說明書提取細胞總 RNA，逆轉錄合成 cDNA。引物為:GILZ(F:5′-TGGTGGTTCTGCGGTGTAAGTG-3′，R:5′-CTCCTCGTGAGATGATGCTTGG-3′，擴增長度為 115 bp)，β-actin(F:5′-GTGGACATCCGCAAAGAC-3′，R:5′-GAAAGGGTGTAACGCAACT-3′，擴增長度為303 bp)。反應條件: 94℃預變性 4分鐘，94℃變性 30秒，64℃ 復性(GILZ)/60℃復性(β-actin)30秒，72℃延伸45秒，35次(GILZ)/30次(β-actin)循環，72℃再延伸5分鐘。將擴增產物110 V下行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.3 細胞免疫熒光法(ICC)檢測GILZ蛋白在9HTE0細胞中的表達定位 將9HTE0細胞懸液以5×104個/孔的細胞數鋪于有小玻片的24孔板中，貼壁后加入終濃度10 μmol/L Dex培養6小時，4%多聚甲醛室溫固定30分鐘，0.1%TritonX-100室溫透膜10分鐘，5%BSA室溫封閉30分鐘，滴加一抗4℃過夜后，滴加二抗37℃孵育45分鐘，DAPI染核，漂洗，抗淬滅劑封片，熒光觀察。

1.2.4 Lipofectamine 2000轉染9HTE0細胞 用無抗無血清DMEM培養9HTE0細胞，根據轉染試劑說明書按比例加入OPTI-MEM和SiRNA(GILZ-SiRNA1:5′-GGAUCUGGUGAAGAAUCAUTT-3′，GILZ-SiRNA2:5′-GAACUCCCAGCUAGAGCGUTT-3′，GILZ-SiRNA3:5′-GUUCCAGUCCUGUCUGAGCTT-3′)的混合液于培養基中輕輕混勻，6小時后更換新鮮培養基，24小時時加入終濃度10 μmol/L Dex刺激，48小時時提取細胞RNA并逆轉成cDNA，-20℃保存及提取蛋白BCA測蛋白濃度后，-80℃保存備用。

1.2.5 Q-PCR檢測 3條 GILZ-SiRNAs沉默后的GILZ mRNA水平 將保存的cDNA取出，用SYBR Green 檢測各組(GILZ-SiRNA1、GILZ-SiRNA2、GILZSiRNA3、陰性對照、GAPDH陽性對照)GILZ mRNA水平。GAPDH 引物:F:5′-AAGAAGGTGGTGAAGCAGGC-3′，R:5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′，擴增長度為203 bp。反應條件:95℃預變性3分鐘，40次循環[95℃變性30秒，64℃退火(GILZ)/60℃退火(GAPDH)30秒]兩步法。

1.2.6 蛋白質免疫印跡法(Western blot)檢測GILZ蛋白的表達情況及其對Raf-1、Mek1/2、Erk1/2磷酸化蛋白及總蛋白的影響 按蛋白分子量配制相應濃度的SDS-PAGE凝膠，蛋白于100℃沸煮5分鐘后，取總蛋白100μg在濃縮膠60 V、分離膠120 V下電泳，電泳結束后將蛋白半干轉到PVDF膜上，5%的BSA室溫下封閉1小時，TBST洗膜10分鐘×3次，用封閉液稀釋的 GILZ(1∶100)/β-actin(1∶2 000)/ p-Raf-1、Raf-1、p-Mek1/2、Mek1/2、p-Erk1/2、Erk1/2 (1∶1 000)4℃孵育過夜，TBST洗膜10分鐘×3次，再用封閉液稀釋的辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠/兔二抗(1∶5 000)室溫下孵育1～2小時，TBST洗膜10分鐘×3次，按ECL顯色試劑盒說明書操作曝光顯影。

1.3 統計學分析 采用SPSS16.0統計軟件行組間方差分析，數據以±s表示，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Dex誘導人氣道上皮細胞9HTE0GILZ mRNA的表達 RT-PCR檢測人氣道上皮細胞9HTE0在10 μmol/L Dex作用6、12及24小時后，6小時 GILZ mRNA即出現顯著增高，12、24小時仍明顯高于正常組，如圖1所示。

2.2 Dex誘導人氣道上皮細胞9HTE0GILZ蛋白的定位 細胞免疫熒光發現GILZ蛋白主要定位于細胞漿中，10 μmol/L Dex作用6小時后可見GILZ蛋白表達明顯高于正常組，如圖2所示。

2.3 Dex誘導人氣道上皮細胞9HTE0GILZ蛋白的表達 人氣道上皮細胞9HTE0在10 μmol/L Dex作用6、12、24小時后，可見正常組GILZ蛋白無明顯表達，6小時時表達即出現明顯增高，12小時達到高峰，如圖3所示。

2.4 GILZ-SiRNAs轉染人氣道上皮細胞9HTE0后GILZ mRNA的沉默效果鑒定 Q-PCR檢測三條GILZ-SiRNAs的沉默效果，control組(0.61 ±0.24)與 Si-negative組(0.51 ±0.20)比較，差異無統計學意義(P ＞0.05);GILZ-SiRNA1、GILZ-SiRNA3 分別為(0.27 ±0.06)、(0.22 ±0.04)，與 Si-negative 組比較差異具有統計學意義(P＜0.05);GILZ-SiRNA2為(0.36±0.12)，與 Si-negative組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。由此可以看出GILZ-SiRNA3的沉默效果最佳，相對Si-negative組的沉默效率可達到55.8%，故選用GILZ-SiRNA3進行后續實驗，如圖4所示。

圖1 不同時間點GILZ mRNA RT-PCR圖Fig.1 RT-PCR of GILZ mRNA in different times

圖2 GILZ蛋白免疫熒光的觀察(×400)Fig.2 The fluorescence expression of GILZ protein(×400)

圖3 不同時間點GILZ蛋白在9HTE0中表達Fig.3 The expression of GILZ protein in different times in 9HTE0

2.5 GILZ-SiRNA3轉染人氣道上皮細胞9HTE0后GILZ蛋白的表達 將GILZ-SiRNA3轉染9HTE0后，WB檢測其蛋白沉默情況，可見GILZ-SiRNA3蛋白表達量較對照組明顯減少，蛋白沉默效果佳，如圖5所示。

2.6 GILZ對MAPK信號通路因子 Raf-1、Mek1/2、Erk1/2磷酸化及總蛋白的表達影響 GILZ-SiRNA3轉染9HTE0后WB檢測MAPK信號通路相關因子，可見在磷酸化水平上，Dex刺激組均抑制了MAPK信號通路相關因子Raf-1、Mek1/2、Erk1/2磷酸化蛋白的表達，而GILZ-SiRNA沉默組則減輕了Dex的抑制作用，提示 GILZ具有抑制 Raf-1、Mek1/2、Erk1/2磷酸化的作用;而在 Raf-1、Mek1/2、Erk1/2總蛋白水平上，各組無明顯差異，提示GILZ不影響總蛋白表達，如圖6所示。

圖4 GILZ-SiRNAs轉染9HTE0后GILZ mRNA的表達Fig.4 The expression of GILZ mRNA after GILZ-siRNAs transfected 9HTE0

圖5 GILZ-SiRNA3轉染9HTE0后GILZ蛋白的表達Fig.5 The expression of GILZ protein after GILZ-SiRNA3 transfected 9HTE0

圖6 MAPK信號通路因子Raf-1、Mek1/2、Erk1/2磷酸化及總蛋白的表達Fig.6 The expression of phosphorylated and total proteins of Raf-1，Mek1/2，Erk1/2

3 討論

支氣管哮喘是嚴重威脅人類健康的常見病，其發病率和死亡率仍呈逐年上升的趨勢，GC作為治療支氣管哮喘的常用藥物，雖然能有效控制氣道炎癥，但研究顯示其對氣道損傷后的修復有抑制作用。1997年意大利科學家D′Adamio等[4]在用Dex處理小鼠胸腺淋巴細胞時發現GILZ的表達后，對GILZ的研究隨之展開。GILZ屬于轉錄因子TSC-22家族，含有N末端結構域、中間的亮氨酸拉鏈結構和C末端的多聚脯氨酸富集結構域，可被臨床上廣泛使用的GC所誘導產生，并能在許多組織及細胞中被快速誘導，調節著增殖、分化以及凋亡等功能[5]，同時GILZ還抑制炎癥分子NF-κB和AP-1的轉錄，調節T細胞的活化、IL-2的產生、抑制Raf-1信號通路以及增加上皮鈉通道的數量等[2，6-8]。國外有研究顯示Dex能夠快速誘導多發性骨髓瘤細胞中GILZ的產生，同時在4小時內能誘導氣道上皮細胞GILZ的表達并具有時間依賴性[9，10]。本文通過Dex作用于人氣道上皮細胞9HTE0，發現正常組中GILZ的 mRNA表達含量較低，而幾乎檢測不到蛋白的表達，但在Dex刺激6小時時即可見明顯的GILZ mRNA及蛋白的升高，提示 GC能夠快速誘導 GILZ的表達。

氣道上皮作為機體內外環境相互作用的屏障，其結構和功能的完整性是維持氣道局部微環境的重要條件。氣道上皮的損傷是哮喘的重要病理基礎，長期使用GC可能是導致氣道上皮損傷的重要危險因素，GILZ雖然在哮喘抗炎中發揮一定的作用，但同時GILZ也通過抑制Raf-1磷酸化阻斷了MAPK信號通路的激活[2，11]。本實驗證實 GILZ 抑制了MAPK信號通路因子Raf-1、Mek1/2、Erk1/2蛋白磷酸化水平，從而影響了MAPK信號通路的傳導，而氣道上皮損傷后修復又主要是通過表皮生長因子與其受體相互作用，通過激活MAPK信號通路來實現的[12]，故GILZ在抗炎的同時也抑制了氣道上皮的損傷后修復，為哮喘的治療增加了難度。因此，如何發揮GILZ抗炎作用的同時，尋找到干預GILZ抑制氣道上皮損傷后修復的藥物，達到既控制哮喘氣道炎癥又促進氣道上皮損傷后修復的目的，是我們下一步亟待研究的主要方向。

1 Riccardi C.GILZ(glucocorticoid-induced leucine zipper)，a mediator of the anti-inflammatory and immunosuppressive activity of glucocorticoids[J].Ann Ig，2010;22(1):53-59.

2 Ayroldi E，Zollo O，Macchiarulo A et al.Glucocorticoid-induced leucine zipper inhibits the Raf-extracellular signal-regulated kinase pathway by binding to Raf-1[J].Mol Cell Biol，2002;22(22):7929-7941.

3 Wadsworth S J，Nijmeh H S，Hall I P.Glucocorticoids increase repair potential in a novel in vitro human airway epithelial wounding model[J].J Clin Immunol，2006;26(4):376-387.

4 D’Adamio F，Zollo O，Moraca R et al.A new dexamethasone-induced gene of the leucine zipper family protects T lymphocytes from TCR/ CD3-activated cell death[J].Immunity，1997;7(6):803-812.

5 Ayroldi E，Riccardi C.Glucocorticoid-induced leucine zipper(GILZ): a new important mediator of glucocorticoid action [J].FASEB J，2009;23(11):3649-3658.

6 Ayroldi E，Migliorati G，Bruscoli S et al.Modulation of T-cell activation by the glucocorticoid-induced leucine zipper factor via inhibition of nuclear factor kappaB[J].Blood，2001;98(3):743-753.

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11 Stellato C.Glucocorticoid actions on airway epithelial responses in immunity functional outcomes and molecular targets[J].J Allergy Clin Immunol，2007;120(6):1247-1263.

12 Wadsworth S J，Nijmeh H S，Hall I P.Glucocorticoids increase eepair potential in a novel in vitro human airway epithelial wounding model[J].J Clin Immunol，2006;26(4):376-387.

[收稿2012-03-29]

(編輯 許四平)

The expression of glucocorticoid-induced leucine zipper(GILZ)and its effect to MAPK signaling pathway in human airway epithelial cells

LIU Jing-Yue，FU Zhou，ZHANG Ming-Xiang，LIU En-Mei，LUO Zheng-Xiu，WANG Li-Jia.Respiratory Center，Children’s Hospital，Chongqing Medical University，Chongqing 400014，China

Objective:To explore the expression of glucocorticoid-induced leucine zipper and the effect of GILZ to Raf-1，Mek1/2，Erk1/2 of MAPK signaling pathway in human airway epithelial 9HTE0cells.MethodsRT-PCR was used to detect GILZ mRNA.GILZ protein was tested by Western blot and located by immunofluorescence.Three synthetic GILZ-SiRNAs were respectively transfected into 9HTE0cells to screen out the best GILZ-SiRNA.Western blot assayed the phosphorylated and total proteins of Raf-1，Mek1/2，Erk1/2.ResultsGILZ mRNA and protein increased obviously with Dexamethasone stimulation and GILZ protein mainly expressed in cell cytoplasm of 9HTE0cells.The phosphorylation of Raf-1，Mek1/2，Erk1/2 protein of which Dexamethasone inhibited the expression rebounded after GILZ-SiRNA was transfected.ConclusionGlucocorticoid as the fist line treatment of asthma induced the expression of GILZ that played a certain anti-inflammatory effect，but GILZ inhibited the activation of MAPK signaling pathway which promoted the repair process of airway epithelial cells.This provided a theoretical basis for new therapeuticmeasures of clinical research in asthma.

Glucocorticoid;GILZ;Airway epithelial cell;MAPK;Asthma

R725.6

A

1000-484X(2012)08-0737-05

10.3969/j.issn.1000-484X.2012.08.014①本文受國家自然科學基金項目(81070014)和重慶市衛生局重點項目(2010-01-46)資助

②重慶醫科大學附屬兒童醫院發育疾病研究教育部重點實驗室，重慶400014

劉靜月(1985年-)，女，在讀博士，主要從事哮喘發病機

理及防治的研究，E-mail:liujingyue219@yahoo.com.cn;通訊作者及指導教師:符 州(1963年-)，男，教授，博士生導師，主要從事小兒呼吸疾病的研究，E-mail:fu_ zhou79@yahoo.com.cn。