三種大豆分離蛋白的比較研究和物化特性相關性分析

范 媛，馬永強，袁美玲，李 丹

（1.哈爾濱米旗食品有限公司，哈爾濱 150060；2.哈爾濱商業大學食品工程學院，哈爾濱 150076；3.黑龍江省普通高等學校食品科學與工程重點實驗室，哈爾濱 150076）

大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）是以低溫脫溶大豆粕為原料生產的一種全價大豆蛋白，其蛋白質含量在90%以上，是植物蛋白中為數不多的可替代動物蛋白的品種之一。大豆分離蛋白除具有營養價值外，還具有許多重要的功能特性，如凝膠性、溶解性、乳化性、乳化穩定性、粘性等，這些特性可有效地改善食品的口感，增加食品的彈性、保水性、吸油性，提高貯存性等[1]。大豆分離蛋白組成和結構是決定其功能性的重要因素，近幾十年來備受國內外研究者的關注[2]。相關研究與工業化實踐的資料都顯示，不同生產企業的大豆分離蛋白在功能特性方面具有顯著差異，而這些差異主要是由于加工工藝條件的差異導致的[3]。

本研究選取了不同生產企業的大豆分離蛋白樣品，通過對其基本化學組成、表面基團和功能性的研究，了解前2方面因素對功能性的影響，以期為進一步探討上述影響奠定理論基礎。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗原料 3種大豆分離蛋白樣品分別由吉林省、黑龍江省和山東省的大豆蛋白生產企業提供。

1.1.2 實驗儀器 TGL-16G-B型臺式高速離心機：湖南星科科學儀器有限公司；722E型可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；DZF-6020真空干燥箱：上海一恒科技有限公司；NDJ-8S型數顯粘度計：上海精密科學儀器有限公司；202型電熱恒溫干燥箱：余姚市東方電工儀器廠；KDN-F自動定氮儀：上海纖檢儀器有限公司；FSH-2可調高速勻漿機：常州國華電器有限公司；TA-XT2i質構儀：英國Stable Micro Systems Ltd公司。

1.1.3 試劑 硫酸銅、硫酸鉀、氫氧化鈉、甲基紅、亞甲基藍、十二烷基磺酸鈉、尿素、亞硫酸鈉等均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料的基本組成分析

（1）水分測定 水分含量測定采用直接干燥法。

（2）灰分測定 灰分測定采用干法灰化法。

（3）蛋白質測定 采用凱氏定氮法。

（4）粗脂肪測定 采用索氏提取法。

1.2.2 蛋白表面基團的測定

（1）蛋白表面巰基的測定 采用分光光度法測定[4]。

①溶液配制方法：

緩沖液A：8mol/L尿素，3mmol/L EDTA，l%SDS和0.2mol/L Tris-HC1（pH8.0）；

緩沖液B：10mmol/L DTNB，0.2mol/L Tris-HC1（pH8.0）；

緩沖液C：8mol/L尿素，3mmol/L EDTA，1%SDS，0.1mol/L Na2SO3，10mL/L NTSB和0.2mol/L Tris-HC1（pH9.5）；

緩沖液D：8mol/L尿素，3mmol/L EDTA，1%SDS，0.1mol/L Na2SO3，0.2mol/L Tris-HC1（pH 8.0）；

NTSB的制備：100mg的Ellment試劑溶解到10mL 1mol/L的亞硫酸鈉中，在38℃下通入氧氣直到亮紅色溶液變成淡黃色，就表明NTSB已經生成。

②測定方法：直接用緩沖液A 20mL溶解0.100g大豆粉（1#），緩沖液D 20mL溶解0.100g大豆粉（2#），振蕩并使其全溶。用緩沖液A 20mL溶解一份處理過的豆漿（1#），緩沖液D 20mL溶解另一份處理過的豆漿（2#），震蕩并使其全溶。取1#溶液于紙型管中，分別測3次后取平均，在紙型管中分別加入0.1mL的緩沖液B，震蕩30min后加緩沖液A稀釋至3mL再測吸光度。以加緩沖液B而不加樣品為空白。取2#溶液于紙型管中，分別測3次，在紙型管中加入相同量的緩沖液C振蕩30min后加緩沖液D稀釋至3mL再測吸光度。以加緩沖液C而不加樣品為空白。

計算公式如下：

SH（μmol/g）=A412nm×D×10-6/C×V×13600

A412nm——吸光度；

D——稀釋倍數（對游離SH，D=（3/所取樣品溶液體積）×20；對總巰基，D=（3/所取樣品體積）×20）；

C——豆漿固形物含量，5mg/mL；

V——所取豆漿或牛奶的體積mL；

SS（μmol/g）=（總巰基含量-游離巰基含量）/2。

（2）表面疏水性的測定 采用SDS結合法測定蛋白質表面疏水性。

①用尿素對大豆分離蛋白進行改性，對改性SPI進行冷凍干燥，研磨，過100目篩，測其表面疏水性。

改性方法：室溫配制8mol/L的尿素溶液。將SPI以1g 1003d110mL的比例加入到尿素溶液中，室溫攪拌4h后冷凍干燥，制得常溫尿素變性大豆分離蛋白[5]。

②測定方法：取改性大豆分離蛋白，溶解于SDS溶液中，靜置30min，在pH為8的磷酸緩沖液中透析24h后取0.5mL透析液，加入10mL CHCl3，混勻后在CHCl3層中加入0.0024%的亞甲基藍溶液，充分混合，2500r/min離心15min，取底層SDS與亞甲基藍混合物，于波長655nm處測其吸光度[6]。

③標準曲線制作：已知含量的SDS按上述測定方法測其吸光度，用1mg蛋白質結合的SDS的微克數來表示蛋白質的疏水性。

1.2.3 大豆分離蛋白物化特性的測定

（1）測定大豆蛋白質溶液粘度 將25g SPI樣品分散到500mL蒸餾水中，分散均勻后，靜置1h，再攪拌2min，80℃水浴60min，冷卻至25℃，再次攪拌2min，立即用旋轉粘度計測定粘度。將旋轉粘度計安裝于固定支架上，校準水平，用直徑不小于70mm的直筒式燒杯盛裝樣液，并保持樣液恒溫，根據估計的被測樣液的最大粘度值選擇適當的轉子及轉速，裝好轉子，調整儀器高度，使轉子浸入樣液直至液面達到標志處為止。接通電源，使轉子在樣液中旋轉，經多次旋轉后指針趨于穩定時或按規定的旋轉時間指針達到恒定值時，壓下操縱桿，同時中斷電源，讀取指針所指示的數值。如讀數值過高或過低，應改變轉速或轉子，以使讀數在20～90之間，選擇4號轉子，0.6轉/min。

（2）乳化性與乳化穩定性 在0.05mol/L pH7.0磷酸鈉緩沖液中配置1%的大豆分離蛋白溶液，加入大豆油（0.25L/L），均質（10000r/min×10s）2次，形成均一的乳化液。均質后，分別在0min和10min取1mL新制備的乳化液，用蒸餾水稀釋100倍，然后再取1mL被稀釋的乳化液，用0.1%SDS稀釋10倍，將最后溶液在500nm下進行吸光值測定[7]。

A0——均質后0min時被稀釋的乳化液的吸光值；

A10——均質后10min時被稀釋的乳化液的吸光值；

t——時間（10min）。

（3）大豆分離蛋白凝膠性質分析

①凝膠的制備：將蛋白質溶于去離子水中，濃度為12%（w/v）， 攪拌均勻， 用分散器（Ultra-TURRAXT25）分散1min（12500r/min），均質20MPa，將此蛋白質溶液裝于100mL的燒杯中，蓋以鋁箔，將此燒杯置于90℃的水浴中加熱保溫30min，然后用冰浴冷卻至室溫，在4℃的冰箱中保存24h，從冰箱中取出立即測定其凝膠強度[8]。

②凝膠強度的測定：選用TA.XT2物性儀進行測定，物性儀主要參數設定如下[9]：

運行模式：TPA

數據采集速率：200pps

探頭：10mm圓柱型（P/0.5）

1.2.4 物化特性與蛋白組成及表面基團的相關性分析 采用SPSS11.0軟件進行線性回歸分析。

2 數據分析與討論

2.1 原料的基本組成分析

大豆分離蛋白基本組成分析見表1。

2.2 蛋白表面基團的測定

不同大豆分離蛋白巰基、二硫鍵含量及疏水性見表2。

計算公式如下：

表1 大豆分離蛋白基本組成分析 %

表2 不同大豆分離蛋白巰基、二硫鍵含量及疏水性

2.3 大豆分離蛋白物化特性的測定

2.3.1 大豆分離蛋白粘度測定 相關數據見表3。

2.3.2 大豆分離蛋白乳化性及乳化穩定性測定 相關數據見表4。

表3 不同大豆分離蛋白的粘度值

表4 不同大豆分離蛋白的乳化性與乳化穩定性

2.3.3 大豆分離蛋白凝膠強度測定 測定結果見附圖，相關數據見表5。

表5 凝膠性質測定數據

2.4 數據相關性分析

根據SPSS軟件分析顯示：

（1）建立粘度（Y）與各測定指標之間的相關性，得到線性回歸方程為：

X1—水分；X2—灰分；X3—脂肪；X4—蛋白質含量；X5—游離巰基；X7—二硫鍵含量。

根據軟件分析得出：粘度與蛋白質含量、二硫鍵含量、游離巰基含量具有顯著的相關性。粘度與蛋白質含量之間具有正相關性，大豆分離蛋白的粘度隨著蛋白質含量增加而增加。大豆分離蛋白的表觀粘度隨蛋白質濃度的增加呈指數型增加。這是因為大豆分離蛋白的主要成分是大豆球蛋白和伴球蛋白，而球蛋白的軸比近于1，要使分子排列平行于流動方向所需的能量遠小于具有較高軸比的纖維狀蛋白質。在后一種情況下，與流體流動方向垂直的某些分子的取向增加流動時的摩擦力。在較高濃度的蛋白質溶液中即有類似的效應發生。在這種情況下，一個分子周圍流動模式的紊亂將會與另一個分子周圍的流動模式紊亂發生相互作用或重疊，從而增加流動時的摩擦力。大豆分離蛋白粘度隨濃度呈指數型增長的現象，是由上述效應引起的。

粘度與二硫鍵含量之間具有正相關性，粘度隨二硫鍵含量增加而增強。二硫鍵含量增加導致分子間作用力加強，增加了分子間的摩擦力，導致粘度增加。

粘度與巰基含量之間具有負相關性，粘度隨巰基含量的增加而降低。巰基含量增加、二硫鍵含量減少導致分子間作用力減弱，減小了分子間的摩擦力，導致粘度降低。

（2）建立乳化性與各測定指標之間的相關性，得到線性回歸方程為：

根據軟件分析得出：乳化性與蛋白質含量具有顯著的相關性。

乳化性與蛋白質含量之間具有正相關性，大豆分離蛋白的乳化性隨著蛋白質含量增加而增強。蛋白質分子中由于同時含有親水基團和親油基團這種特征結構，因此具有乳化性，蛋白質含量高時親水和親油基團也隨之增加，因此乳化性也隨之增加。

（3）建立乳化穩定性與各測定指標之間的相關性，得到線性回歸方程為：

根據軟件分析得出：乳化穩定性與各指標之間相關性均不顯著。

（4）建立凝膠性與各測定指標之間的相關性，得到線性回歸方程為：

根據軟件分析得出：凝膠性與蛋白質含量、二硫鍵含量、游離巰基含量具有顯著的相關性。凝膠性與蛋白質含量之間具有正相關性，大豆分離蛋白的凝膠性隨著蛋白質含量增加而增加。大豆蛋白質的濃度是凝膠能否形成的決定性因素之一。濃度為8.0%～16.0%的大豆蛋白質溶膠，經一定的加熱過程，冷卻后即可形成凝膠，濃度越高，凝膠強度越大。

凝膠性與二硫鍵之間具有正相關性，凝膠強度及性能隨二硫鍵含量增加而增強。加熱導致大豆分離蛋白變性分子形成，由大豆蛋白內的二硫鍵、氫鍵、疏水鍵作用使解鏈的肽鏈間重新交聯成網絡從而形成了凝膠網絡結構。因此高含量的二硫鍵傾向于形成凝膠，從而導致凝膠性較好。

凝膠性與游離巰基含量之間具有負相關性，凝膠強度及性能隨巰基含量增加而減弱。巰基含量高時，二硫鍵含量隨之減少，導致肽鏈間重新交聯減弱，從而使凝膠強度降低。

3 結論

由表面特性分析可知：3種大豆分離蛋白中的游離巰基和二硫鍵含量由多到少的順序均為：樣品1>樣品2>樣品3。樣品2的疏水值高于樣品1和樣品3，說明處理后得到的樣品2蛋白質表面疏水鍵暴露較多，疏水基含量較高，疏水性較強。通過SPSS軟件分析可知：大豆分離蛋白中粘度與蛋白質含量、二硫鍵含量呈正相關、與巰基含量呈負相關；大豆分離蛋白的乳化性與蛋白質含量、粘度、蛋白質組成中7S組分含量呈正相關；大豆分離蛋白的凝膠性與蛋白含量、二硫鍵含量呈正相關，與巰基含量呈負相關。

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［6］唐凱,俞稼鏞.陰離子表面活性劑的測定方法——混合指示劑程序加入法[J].蘭州大學學報,2000,36(4):61-65.

［7］郭興鳳,慕運動,阮詩豐.不同測定方法對大豆分離蛋白乳化性測定結果的影響[J].食品研究與開發,2007,28(2):129-131.

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［9］Zhang Lu,Sun Xiuzhi,SuSan.Effect of Sodium Bisulfite on Properties of Soybean Glycinin[J].Agriculture Food Chemistry,2008,56:11192-11197.