建立NF-κB核轉位的轉基因細胞模型

苑玉和，吳苗苗，劉 巖，胡金鳳，王宏旭，陳乃宏

(天然藥物活性物質與功能國家重點實驗室，中國醫學科學院藥物研究所，北京協和醫學院藥物研究所，北京 100052)

核轉錄因子-kappa B(nuclear factor-kappa B，NF-κB)是一種廣泛表達并發揮重要作用的轉錄因子，具有調控細胞存活、增殖、分化等功能。因在最初發現的時候能與免疫球蛋白的輕鏈(κ鏈)增強子結合并具有轉錄激活活性而命名。因其能夠參與多種基因的轉錄調控，與炎癥反應、免疫應答，以及細胞的增殖、轉化和凋亡等重要的生理病理過程密切相關。目前對于NF-κB活性的檢測多通過免疫印跡、免疫熒光或報告基因的方法，但上述檢測方法中由于樣品的準備過程比較繁瑣，而且樣品不易保存，更重要的是不能夠觀察活細胞的狀態，因此建立一種能夠快速、簡易觀察NF-κB活性的方法對于NF-κB相關通路的研究具有重要的意義。本文將通過構建NF-κB中的p65與綠色熒光蛋白的融合載體，轉染不同的細胞后，建立顯微鏡下直接觀察NF-κB核轉位的細胞模型，對相關化合物的篩選與機制研究具有重要意義。

1 材料

BV-2(小膠質細胞)、PC12(大鼠嗜鉻細胞瘤)購自中國醫學科學院基礎所細胞中心，菌株E.coli DH5α為本室保存;真核表達質粒pEGFP-C1來自Clontech公司。TRIzol購自Amresco，TANScript M-MLV逆轉錄酶購自天根公司，Taq酶、dNTPs、核酸內切酶XhoI、EcoRI和T4 DNA連接酶購自大連寶生物有限公司和Biolab公司，RNase A、Hochest33342購自Sigma公司，DNA MarkerⅡ購自鼎國生物有限公司。核酸純化試劑盒、質粒大提試劑盒購自威格拉斯生物有限公司。所有細胞培養基購自Gibco公司，胎牛血清購自Hyclone公司，實驗耗材購自Corning公司。其他試劑為國產或進口分析純試劑。共聚焦顯微鏡是Leica公司的TCS SP2。

2 方法

2.1 RT-PCR 取小鼠腦組織1 mg，生理鹽水洗2遍，加入TRIzol后，移入EP管中，加入氯仿，振蕩、靜置并離心，取上清;加入異丙醇，離心，棄上清;加入75%乙醇洗滌沉淀。晾干后加入DEPC H2O溶解，得到RNA。以獲得的mRNA為模板，Oligo(dT)16為引物，逆轉錄酶TIANScrip M-MLV合成第一鏈。以獲得的cDNA為模板，引物兩端加入XhoI/EcoRI

酶切位點，引物序列如下:正義鏈:5'CCGCTCGAGCTATGGACGATCTGTTTCCCCTC 3';反義鏈:5'CGGAATTCACCTTAGGAGCTGATCTGAC 3'。具體反應條件:94℃預變性4 min;94℃變性60 s;58℃退火60 s;72℃延伸90 s;擴增30個循環。利用核酸提取試劑盒純化擴增的基因片斷(方法參照說明書)。

2.2 pEGFP-C1-p65的構建及鑒定 T4DNA連接酶連接經XhoI/EcoRI消化后的基因片斷和載體，16℃過夜連接后轉化大腸桿菌DH5α，卡那霉素(Kan+)篩選得到的克隆經培養擴增后，提取質粒經XhoI/EcoR酶切，獲得的陽性克隆送測序。

2.3 pEGFP-C1-p65在不同細胞中的表達 利用試劑盒提取測序正確的質粒，用于細胞轉染。將PC12或BV-2細胞接種至已包被的玻片或 confocal皿，24 h后利用LipofectimeTM2000進行轉染。轉染后24 h提取全細胞可溶性蛋白，通過Western blot方法確認p65的表達。

2.4 GFP-p65在不同細胞中核轉位的情況 按照“2.3”方法轉染BV-2細胞和PC12細胞，轉染24 h后，BV-2細胞給予LPS(100 μg·L－1)，孵育8～24 h后，可直接通過共聚焦顯微鏡觀察。

3 結果

3.1 成功構建pEGFP-C1-p65融合載體 提取Kana+篩選菌株的質粒，電泳質粒的XhoI/EcoRI酶切產物，在1 600 bp附近發現有特異性條帶，與PCR產物大小一致(Fig 1)。同時測序結果也表明鼠源p65基因片斷成功插入載體pEGFP-C1。

Fig 1 p65 recombinant vectors digested by XhoI/EcoRI

3.2 Western blot法檢測GFP-p65在BV-2細胞中的表達

過表達p65細胞株裂解的總蛋白經SDS-PAGE分離后，分別加入anti-p65和anti-GFP抗體進行免疫印跡，在分子質量90 ku均有特異性條帶。該條帶為GFP-p65融合蛋白，是轉染后表達的外源性蛋白，對照組(僅轉染pEGFP-C1)中在該分子質量處則無明顯條帶;而作為內參的β-actin的表達量是一致的(Fig 2)，由此表明模型組中p65的表達量明顯增加。

Fig 2 p65 expression increased in transgenic model

3.3 LPS能夠誘導BV-2細胞中的p65發生核轉位 LPS是革蘭陰性桿菌細胞壁的主要成分，在免疫應答研究中常被作為一種多克隆免疫激發劑來模擬機體免疫激發狀態，是研究炎癥反應常用的試劑。研究發現(Fig3 A)轉染空載體pEGFP-C1后，熒光蛋白在全細胞表達，而轉染pEGFP-C1-p65后熒光蛋白主要在細胞質表達，細胞核內未出現熒光蛋白。而給予LPS刺激轉染pEGFP-C1-p65的BV-2細胞后，綠色熒光蛋白標記的p65則發生核轉位的現象(Fig 3 B)。

Fig 3A GFP-p65 overexpressed in BV-2 cells

Fig 3B GFP-p65 in BV-2 cells translocated into nucleus when BV-2 cells were exposed to LPS

3.4 GFP-p65在PC12細胞中的表達 NF-κB不僅作為重要的轉錄因子參與炎癥反應，同時也能夠調控神經元的存活與死亡。將pEGFP-C1-p65轉染PC12細胞后，GFP-p65融合蛋白在有的細胞中主要分布在胞質中，而在有的細胞中同時分布與細胞核中(Fig 4)，這種分布形式不同于在BV-2細胞的表達，這表明p65在神經元中表達的不均一性。

Fig 4 GFP-p65 overexpressed in PC12 cells

4 討論

NF-κB是真核細胞轉錄因子Rel蛋白質家族成員，包括5種:NF-κB1(p50/p105)、NF-κB2(p52/p100)、RelA(p65)、RelB和C-Bel。其中哺乳動物最多見的NF-κB因子是由p50和 p65兩個多肽組成的異源二聚體，它在細胞內相對穩定表達，是最主要的可以被誘導的二聚體。在NF-κB的異源二聚體中，雖然兩種亞單位均能與DNA結合，但只有p65蛋白的C-末端含有轉錄激活區域，能直接作用于靶基因而激活轉錄。因此目前可通過檢測p65的表達、分布的改變評價NF-κB活性的變化。基于上述原理，本文通過PCR的方法獲得p65基因，與綠色熒光蛋白(GFP)的基因融合后，構建能夠在哺乳動物細胞中表達的融合載體，通過綠色熒光蛋白的指示，在顯微鏡下直接觀察p65的表達與分布，尤其是核轉位的情況，由此可更直接觀察NF-κB轉錄因子活性的變化。

靜止狀態下，NF-κB以非活性形式存在于胞質中，當細胞受炎癥、感染、損傷或應激等刺激后激活NF-κB［1］，使NF-κB快速易位進入核內，與靶基因κB位點結合，迅速誘導靶基因的轉錄［2］。NF-κB廣泛分布于幾乎所有的組織和細胞中，通過影響靶基因的表達調控而影響細胞的功能。由于調節靶基因的不同，因而NF-κB發揮的功能也明顯不同。

在神經系統中，NF-κB同樣發揮著重要的作用，參與神經系統發育，并與腦缺血、腦損傷等疾病尤其是神經退行性疾病密切相關［3－4］，因此有學者提出NF-κB可作為治療神經退行性疾病的靶點［5］。

在免疫系統中能夠激活NF-κB的刺激在神經系統中同樣能夠發揮作用。BV-2細胞是來源于小鼠的小膠質細胞系，利用該細胞系能夠進行神經系統炎癥的相關研究。近幾年的研究表明，神經系統炎癥與多種疾病關系密切，尤其與神經退行性疾病的發生、發展密不可分［6］。研究表明給予LPS刺激BV-2細胞，能夠激活NF-κB信號傳導通路［7］，而在本研究中同樣發現利用LPS刺激小膠質BV-2細胞，GFP-p65能夠發生核轉位的情況，由此表明觀察基于綠色熒光蛋白與p65融合蛋白的的核轉位情況，可研究膠質細胞中NF-κB活性的改變，由此對神經炎癥相關的問題進行研究。

在神經系統中，NF-κB不僅能夠調節膠質細胞的功能，同時對神經元存活、死亡、分化及突觸可塑性方面發揮著至關重要的作用［8］。多種因素能夠調控在神經元中NF-κB的活性，其中包括神經營養因子，如NGF能夠通過受體激活NF-κB［9］，對神經元發揮保護作用，同時對調控突觸可塑性也具有重要的意義。

GFP-p65在PC12中表達，在不同的細胞中其亞細胞定位并不相同，在有的細胞中僅在胞質中表達，而有的也同時存在于細胞核中，呈現細胞表達的不均一現象。由此說明對于同一種刺激，不同的細胞反應并不完全相同，這可能與細胞所處的周期或狀態不同有關。

目前已成功建立p65轉基因細胞模型，為以NF-κB為靶點的創新藥物研制提供了良好的研究平臺，同時基于NF-κB對神經元的保護功能及對突觸可塑性的調節功能，觀察GFP標記的p65可對某些作用于神經元的創新藥物的作用機制進行深入的研究。

［1］ Pahl H L.Activators and target genes of Rel/NF-kappaB transcription factors［J］.Oncogene，1999，18(49):6853－66.

［2］ Hayden M S，Ghosh S.NF-κB in immunobiology［J］.Cell Res，2011，21(2):223－44.

［3］ Memet S.NF-kappaB functions in the nervous system:from development to disease［J］.Biochem Pharmacol，2006，72(9):1180－95.

［4］ 李震徐，新 穎，沈 衛，郭云良.胡黃連苷Ⅱ對大鼠腦缺血/再灌注損傷NF-κB和I-κB的干預作用［J］.中國藥理學通報，2010，26(1):52－6.

［4］ Li Z X，Xin Y，Shen W，Guo Y L.The interferring effects of picrosideⅡon the expressions of NF-κB andⅠ-κB following cerebral ischemia reperfusion injury in rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(1):52－6.

［5］ Camandola S，Mattson M P.NF-kappa B as a therapeutic target in neurodegenerative diseases［J］.Expert Opin Ther Targets，2007，11 (2):123－32.

［6］ Brown G C，Neher J J.Inflammatory neurodegeneration and mechanisms of microglial killing of neurons［J］.Mol Neurobiol，2010，41 (2－3):242－7.

［7］ Svensson C，Fernaeus S Z，Part K，et al.LPS-induced iNOS expression in Bv-2 cells is suppressed by an oxidative mechanism acting on the JNK pathway-a potential role for neuroprotection［J］.Brain Res，2010，1322(31):1－7.

［8］ Mattson M P，Meffert M K.Roles for NF-kappaB in nerve cell survival，plasticity，and disease［J］.Cell Death Differ，2006，13(5): 852－60.

［9］ Carter B D，Kaltschmidt C，Kaltschmidt B，et al.Selective activation of NF-κB by nerve growth factor through the neurotrophin receptor p75［J］.Science，1996，272(5261):542.