HPLC-MS法測定大鼠血漿中雙-O-甲基四氫呋喃愈創木素B的濃度及藥代動力學參數

徐春蕾，劉史佳，居文政，陳 勇，張 芳，李 祥

(1.南京中醫藥大學藥學院，江蘇南京 210023;2.南京中醫藥大學附屬醫院臨床藥理科，江蘇南京 210029)

中藥三白草(Saururus chinensis)具有利尿消腫，清熱解毒的功效，臨床主要用于治療水腫、小便不利，外治瘡瘍腫毒，濕疹［1］。植物化學和藥理學研究表明黃酮和木脂素類是三白草中主要生物活性物質，具有廣泛的藥理和生物化學活性［2－3］，如抗癌［4］、抗炎［5］、抗氧化［6］等。雙-O-甲基四氫呋喃愈創木素B(DiB，Fig 1)是三白草根中含量最高的四氫呋喃型倍半木脂素，具有較好的抗氧化活性［6］。

有關DiB的藥代動力學研究文獻尚未見報道。本研究首次采用HPLC-MS聯用技術，建立簡便、快速、高效的體內分析方法，研究DiB在大鼠體內的藥代動力學過程，為其在體內的吸收和代謝等進一步研究提供參考。

Fig 1 Chemical structures of DiB(a) and intetnal stardand sauchinone(b)

1 材料

1.1 試藥 DiB和三白草酮對照品(純度﹥98.0%，本實驗室從三白草中分離得到，經1H-NMR，13C-NMR確定結構，HPLC測定純度)，甲醇、乙酸乙酯為色譜純，水為超純水。其余試劑為分析純。

1.2 儀器 Waters 2695液質聯用儀(美國Waters公司)，色譜工作站:Mass Lynx 4.1;梅特勒-托利多 AE240電子天平(上海梅特勒-托利多有限公司);Thermo Micro 17冷凍高速離心機(美國Thermo公司);Millipore Drict-Q5超純水機(法國Millipore公司);WH-2微型漩渦混合儀(上海滬西分析儀器廠);LABCONCOC真空離心濃縮機(美國Thermo公司)。

1.3 動物 Sprague-Dawley(SD)大鼠6只(♂)，體質量(210±10)g，由南京中醫藥大學動物中心提供，合格證號: SCXK(蘇)2008-0004。

2 方法與結果

2.1 給藥方案

2.1.1 靜脈給藥溶液的配制 用甘油-乙醇-水(體積比為5∶5∶90)配制成2.5 g·L－1的DiB溶液，臨用前配制。

2.1.2 給藥與樣品采集 SD大鼠6只，給藥前12 h禁食不禁水，分別尾靜脈注射DiB溶液10 mg·kg－1，于給藥前及給藥后0.08、0.17、0.25、0.33、0.67、1、1.5、2、3、5、7、10 h，眼眶靜脈叢采血約0.3 ml于肝素化的1.5 ml離心管中，2 400×g離心5 min，取上層血漿，置－20℃保存待測。

2.2 對照品溶液的配制

2.2.1 DiB對照品溶液的配制 精密稱取適量DiB，用甲醇配制成1.0 g·L－1的儲備液。精密吸取適量，用甲醇分別稀釋成0.25、0.5、1.0、2.5、5.0、10、25和50 mg·L－1的標準系列溶液，于4℃保存，備用。

2.2.2 內標溶液的配制 精密稱取適量三白草酮對照品，用甲醇溶解并稀釋至1.5 mg·L－1，于4℃保存，備用。

2.3 血漿樣品預處理 在1.5 ml離心管中加入室溫解凍后的血漿樣品90 μl，內標溶液10 μl，0.5 ml乙酸乙酯，混懸3 min后于13 800×g離心5 min，取上清液于35℃真空離心濃縮至干，再加入100 μl甲醇復溶，混旋2 min后，13 800×g離心5 min，取上清液進樣。

2.4 色譜及質譜檢測條件 色譜柱:Agilent Zorbax SB-C18 (150 mm×2.1 mm，5 μm)，保護柱Agilent Zorbax SB-C18 (12.5 mm×2.1 mm，5 μm)，流動相:甲醇-水(80∶20，V/ V)，流速:0.2 ml·min－1，柱溫:35℃。離子化方式為電噴霧(ESI)，選擇性離子檢測(SIR)，檢測離子為正離子。DiB和三白草酮均為［M+Na］+，m/z分別為395.4和379.4。毛細管電壓:3.2 kV，錐孔電壓:50 V，離子源溫度:110℃，脫溶劑溫度:350℃，脫溶劑氣體(N2)流速:450 L·h－1。

2.5 方法學驗證

2.5.1 方法專屬性 本色譜條件下，DiB和三白草酮的保留時間約為4.63和5.90 min(Fig 2)。采用選擇性離子檢測方式，其專屬性強，靈敏度高，血漿中雜質不干擾樣品的測定。

2.5.2 標準曲線的制作與最低定量限(LLQD)考察 分別吸取“2.2.1”項下的系列標準溶液和“2.2.2”項下的內標溶液10 μl，加入到80 μl空白血漿中，配制成相當于DiB濃度分別為0.025、0.05、0.10、0.25、0.50、1.0、2.5和5.0 mg· L－1，內標濃度為0.15 mg·L－1的血漿樣品。按“2.3”項下操作，以血漿中DiB的濃度為橫坐標(X)，以DiB和內標峰面積的比值為縱坐標(Y)，用最小二乘法回歸運算，得直線回歸方程:Y=3.4750X+0.0065，r=0.998 5。結果表明DiB濃度在0.025～5.0 mg·L－1間線性關系良好。按以上條件測得血漿中DiB的最低定量限為0.025 mg·L－1。

2.5.3 準確度、精密度考察 分別吸取“2.2.1”項下的相應濃度標準溶液和“2.2.2”項下的內標溶液10 μl，加入到80 μl空白血漿中，配制成相當于DiB濃度分別為0.025、0.25、2.5 mg·L－1，內標濃度為0.15 mg·L－1的低、中、高3個濃度的質量控制樣品(Quality control，QC)，按“2.3”項下操作，以當日標準曲線計算QC樣品的測得濃度，以測得濃度平均值/配制濃度×100%表示準確度，以相對標準偏差表示精密度。結果表明，日內、日間準確度分別為98.7% ～105.8%(RSD≤6.6%，n=5)和93.2% ～101.9%(RSD≤10.0%，n=3)，實驗數據表明，測定大鼠血漿中DiB的分析方法符合“guidance for Industry:Bioanalytical Method Validation(FDA，May 2001)”的相關規定。

Fig 2 Chromatograms of DiB 1 and IS 2

2.5.4 穩定性考察 經考察低、中、高3個濃度(0.025、0.25、2.5 mg·L－1)的QC樣品在反復凍融3次，－20℃貯存2周，室溫放置24 h條件下測定結果見Tab 1，說明在測定條件下樣品穩定。2.5.5 提取回收率和介質效應［7，8］配制含 DiB濃度為0.025、0.25、2.5 mg·L－1的 QC樣品，不加內標，其余按“2.3”項下操作測定，得峰面積A1。取空白血漿，不加內標，其余按“2.3”項下處理后，再分別加入相應濃度(0.025、0.25、 2.5 mg·L－1)的DiB標準液進行測定，得峰面積A2。提取回收率=A1/A2×100%。取與空白血漿等量的水，加入相應濃度的DiB標準液進行測定，得峰面積A3。介質效應= A2/A3×100%。3個濃度平行5份測定，取平均值。結果表明，3個濃度的提取回收率介于91.1%～97.4%，介質效應介于62.5%～68.2%，離子抑制強度基本一致。內標的提取回收率和介質效應分別為93.8%、64.3%

2.6 大鼠體內的藥代動力學 大鼠單劑量(10 mg·kg－1)注射DiB后的濃度－時間曲線見Fig 3。用DAS 2.0軟件對所測數據進行處理，主要藥動學參數見Tab 2。由分析結果可知，大鼠靜脈注射DiB后的藥動學符合二室開放模型，0-t時的表觀分布容積為(11.44±2.44)mg·h·L－1，消除半衰期為(3.73±1.30)h、血漿清除率為(0.65±0.14)L·h－1· kg－1、中央室分布容積為(3.36±3.19)L·kg－1。

Tab 1 Stability data for DiB(±s，n=5)

Tab 1 Stability data for DiB(±s，n=5)

Added concentration/mg·L －1 0.025 0.25 2.5 Freeze-thaw stability/% 92.56±10.81 97.78±4.48 99.31±2.75 At room temperature for 24 h/% 96.27±7.06 99.87±4.81 100.91±2.49 At－20℃for 2 weeks/% 92.43±13.68 94.76±6.03 98.70±2.01

Tab 2 Main pharmacokinetic parameters of DiB following single dose of 10 mg·kg－1to rats(n=6)

Fig 3 Mean plasma concentration versus time curve of DiB after an i.v.dose of 10 mg·kg－1to rats(n=6).

3 討論

在優化HPLC-MS條件時，比較了不同比例的甲醇-水作流動相，結果甲醇-水為80∶20(V/V)時內標物和DiB的峰形良好，無其他物質的干擾，保留時間恰當。內標選擇三白草酮，該化合物與DiB都從三白草藥材的乙酸乙酯部位分離得到，兩者色譜行為相近，在相同溶劑中的溶解度相近，提取回收率相近。實驗中曾在正、負離子檢測下分別全掃描樣品和內標，發現兩者在正離子模式下的加鈉峰響應最高，測定結果穩定，由此確定兩者的［M+Na］+為檢測離子。

本實驗用乙酸乙酯液液萃取法處理血漿樣品，比較了甲醇、乙腈沉淀蛋白法，結果表明乙酸乙酯萃取法無內源性物質干擾，回收率高，重現性好。而沉淀法處理的樣品顏色較深，雜質多，干擾重。故選用前者。

DiB是三白草中的一種重要的具有藥理活性的木脂素，目前尚未有藥代動力學的研究，因此建立合適的體內分析方法十分重要。HPLC-MS在對DiB血藥濃度的檢測顯示出較強的優越性，分析時間短，靈敏度高，需用血漿量少，便于大鼠連續取血，得到穩定的數據，為DiB的進一步體內研究提供了可靠的分析方法。

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