基質中木聚糖酶活力測定方法的研究進展

王斐

（青島科技大學化工學院，山東 青島 266042）

基質中木聚糖酶活力測定方法的研究進展

王斐

（青島科技大學化工學院，山東 青島 266042）

本文綜述了基質中酶的提取方法及活力測定方法，如粘度法、生色底物法、瓊脂糖擴散法、酶聯吸附分析法和目前使用較多的還原糖法，如DNS法和最新涌現的用于微量測定的MBTH法。并就還原端基法介紹了其具體實驗手段，如試管法、罐法、微孔板法。分析了方法中存在的問題并展望了該方法研究的發展趨勢，如安培法和等溫滴定量熱法等。

木聚糖酶；測定；DNS法；MBTH法；微孔板法

在木聚糖酶的生產、銷售、應用等流通鏈中，酶活力是質量控制的重要技術指標，而其測定方法則是決定結果是否準確的關鍵。根據木聚糖酶的來源及應用，所存在的基質包括微生物發酵液、飼料、食品添加劑、紙漿等。基質中酶活力受多種因素影響，如溫度、pH、激活劑、抑制劑等[1]。另外，為提高酶制劑的穩定性，無活性載體常被用來將酶進行吸附固定，在檢測時如何將酶提取出來也較為關鍵。其測定方法可按原理不同分為粘度法、瓊脂糖擴散法、生色底物法、酶聯吸附分析法和目前使用較多的還原糖法等。

1 基質中酶的提取方法的研究

酶的提取質量受提取溶劑、溫度、提取時間的影響。同一種酶在不同的基質環境中抽提條件也不同。Cosson等[2]在測飼料中木聚糖酶活力時用pH4.8的檸檬酸鈉-磷酸鹽緩沖液在室溫下攪拌提取0.5h，離心取上清作為酶提取液。高玲等[3]研究浙江酶、華芬酶、Avizyme-1500三種酶制劑中木聚糖酶的提取，發現華芬酶、Avizyme-150中最佳抽提條件為0.1mol/L的氯化鈉溶液4℃抽提12h，而浙江酶是蒸餾水4℃提取12h。蘇玉春等[4]采用雙水相法從黑曲霉的發酵液中提取木聚糖酶，即選用PEG4000提取體系，其質量分數為19%，磷酸氫二鉀質量分數為10%，氯化鈉濃度為0，親水性聚合物水溶液在一定條件下形成雙水相后，酶在兩相中分配不同，來達到提純目的[4]。

2 基質中酶提取液的活力測定方法

2.1 粘度法

該法是通過測木聚糖酶對底物粘度的降解率來衡量酶的活性高低，以阿拉伯木聚糖，水溶性木聚糖衍生物等作為底物[5]。底物粘度可通過測流量的粘度計以及振動旋轉粘度計等現代電子設備，引起的電阻變化被轉化為酶活力單位。雖然粘度法比較靈敏，但操作復雜繁瑣，重復性差，不能測定底物的米氏常數，不常使用。

2.2 瓊脂糖擴散法

該法的理論基礎是剛果紅與多糖的顯色反應。將木聚糖和瓊脂混合制成凝膠板，在瓊脂板上切開一條鑿，將酶溶液倒入到鑿內與底物在適當條件下發生酶水解，水解一段時間后通過直接測定水解區域的直徑來反映酶活力的大小[6]。飼料本身還原糖不與剛果紅發生反應，因此有報道將其運用于飼料中木聚糖酶的活力測定。該法操作簡單，雖不受飼料本身還原糖的干擾，但培養時間長，對透明圈的分析較為復雜，準確性低于其他非擴散法。

2.3 酶聯吸附分析法

該法是將生物素基-木聚糖底物包被在酶標板上，加入木聚糖酶在一定溫度條件下酶解后，洗掉已降解的木聚糖，用堿性磷酸酶抗生蛋白鏈菌素偶聯于酶標板上未被降解的生物素基-木聚糖上，然后，加入堿性磷酸酶的底物(對硝基苯磷酸酯)進行顯色反應，根據顯色的深淺來定量未被降解的木聚糖的量，由此間接地測定木聚糖酶的活力[7]。該法操作簡單，成本低，不會因底物中含有過多還原糖而影響測定結果，但是如何針對該方法提取樣品(消化道食糜和飼料)中的酶以及如何消除樣品中的內源底物的干擾等仍有待于解決。

2.4 底物染色法

該法是對底物進行化學修飾后使其帶有特定的熒光物質或染料，在木聚糖酶催化下釋放染料或熒光物質，通過釋放于乙醇中的染料或熒光物質的多少來反映酶活的大小[8]。可用的染料有雷馬氏亮藍(Retnazolbrilliant Blue R,RBB)、剛果紅等，熒光材料有2-(2-苯丙噻唑)酚 (2-(2-benzothiazolyl)-phenyl)、4-甲基傘形酮(4-methylumbelliferyl)、熒光增白劑(Calcofluor)等。目前文獻[9]報道合成一種較好的熒光底物6,8-difluoro-4-methyl-umbelliferyl β-D-xylobioside(DiFMUX2)，找到了內切-β-1,4-木聚糖酶的最佳染色底物為芳基4-硫-β-木糖甘[10]。該類方法操作簡單，但由于底物制備的特殊性，提高了測定成本，且該法對溫度、離子強度、乙醇濃度及影響染色片段溶解度的因素非常敏感。另外，飼料酶作用的底物是酶的天然底物，不宜采用該法測活力。

2.5 還原糖法

該法是利用木聚糖經酶促水解產生的還原端基被氧化所產生產物的量來計算酶活力，包括DNS法、MBTH法等。

2.5.1 DNS法

該法是利用3,5-二硝基水楊酸(DNS)在堿性條件下與木聚糖酶解產物的還原末端反應生成橙黃-棕紅色的氨基化合物，在一定范圍內，還原糖的量和反應液的顏色強度呈比例關系，利用比色法測定還原糖的量來表示酶活力[11]。該法是目前最常采用的方法之一，所得產物顏色穩定性好，操作簡單，蛋白質對測定無干擾，且測定精密度高。但該法的靈敏度較低，特別是對于Km值較大的酶活力測定情況很難測得酶解初速度，從而不能準確的檢測酶含量極低的飼料等基質中的酶活力。

2.5.2 MBTH法

該法同DNS法都屬于還原糖法，原理是3-甲基-2-苯并噻唑酮腙MBTH)首先與酶解液中的還原端基反應生成嗪，過量的MBTH被Fe3+氧化成陽離子，再與嗪反應生成青藍色化合物，在一定范圍內，還原端基的量和反應液的顏色強度呈正比，測定波長為630nm或650nm[12]。MBTH法常應用于微量甲醛含量的測定[13]。由于該法靈敏度較高，在木聚糖酶解程度極低的條件下即可測得酶活力，而水解產物中大分子糖鏈的還原端基不會因分子量的略微變化而有大的反應性改變，即，不同聚合度的同類還原糖，其還原端的顯色吸光系數基本相同，因此，所得活力測定數值不會象DNS法那樣偏離測定真值[14]。該法已被應用于幾丁質酶、溶菌酶的活力測定[15]，其靈敏度比DNS法高十倍以上。

3 還原糖法中木聚糖酶活力的測定手段

盡管某些還原糖法在化學計量方面也存在問題，但由于操作簡便且重復性好，因此被廣泛用于基質中多糖水解酶的活力測定。而其測定手段又較為多樣化，包括試管體系及微孔板法。

3.1 試管法

又稱終點法，酶解反應在試管中進行。酶與底物于試管中混合后于恒溫水浴鍋中進行酶催化反應，反應結束后用終止液終止酶解過程。氧化劑與還原產物進行顯色反應后，用分光光度法測定吸光度值。該法適合于在一定時間內酶解速率不變的活力測定，但不能進行動力學分析。

3.2 微孔板法

該法主要是用96孔板在恒溫振蕩器中進行酶解反應，用酶標儀測定并完成數據的高通量分析。操作過程中最好使用8道式或12道式微量進樣器。該法操作簡單方便、迅速，試劑用量少，一次可處理大量樣品以實現高通量分析，從而降低測定成本，提高測定效率。如Grishutin等[16]將BCA法采用微孔板體系，進行了底物專一性研究。但由于該法對微孔板品質、恒溫振蕩器的溫度均勻性要求較高，因此，其精密度、準確度稍遜于試管法。

4 其它可能用于木聚糖酶活力測定的方法

4.1 安培法

該法是利用酶解產物中還原端基在發生氧化還原反應過程中釋放的電子與還原端基的量呈比例關系的特點來測得還原端基的量從而得到酶活力的。如在鐵氰化鉀安培法中[17]，酶解產生的還原端基在堿性條件下把還原成電化學氧化還原活性物，它能被電極上的正電位氧化為，并釋放一個電子，因此可根據氧化電流信號計算還原糖的含量。

4.2 等溫滴定量熱法

該法適用于Km值較小時的動力學參數測定。其原理是根據酶催化反應時產生的熱量與底物降解速率成比例的關系進行酶活力測定的[18]。多糖降解時所產生的熱量太小，在活力測定時可加入多糖氧化酶和過氧化氫酶來放大反應焓信號。此法靈敏度高于還原糖法，但由于酶催化水解產生較少的還原端基，而造成后續的多糖氧化酶表現較低活性，因此不能準確測定表觀摩爾焓變值。

5 結論

酶是生物活性蛋白質，基質中酶的活力測定還受提取劑、提取溫度及提取時間的影響，基質本身也具有能溶于緩沖液的大量雜性物質，也會對酶活力造成一定損失，使測定結果不準確。由于還原糖法操作簡單、快捷、便于定量，因此迄今為止仍是木聚糖酶最為常用的活力測定方法，其測定手段多樣，可根據測定需要選擇不同方法。其中，DNS法在國家標準中使用最多，但靈敏度較低，所測活力值往往偏高。MBTH法的靈敏度較高，因而可測得酶解初速度，受蛋白質干擾極小，定量準確，且特別適合于基質中低酶活力的測定。粘度法和瓊脂擴散法雖然操作繁瑣、耗時、很難準確定量，但在配料中含有大量還原性物質時，可用于待測樣品間的活力比較或用于木聚糖酶高產菌株的篩選。此外，在還原端基法基礎上應用安培法可提高測定的靈敏度，等溫滴定量熱法的靈敏度高于還原糖法中的所有方法，有望應用于含木聚糖酶的動力學及痕量酶活力測定。

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10.3969/j.issn.1008-1267.2012.05.005

T925+9

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2012-04-20