水蛭素對增生性瘢痕基質金屬蛋白酶-2、9表達作用的影響

李開通，劉達恩，陳小婷，魯海強，李順堂

(廣西醫科大學第一附屬醫院，南寧530021)

當皮膚損傷達到一定深度和范圍時，組織自然修復的結局便是瘢痕形成。皮膚創傷愈合過程分為炎癥期、增生期、重塑期。在重塑期，填補組織缺損的肉芽組織逐漸發生纖維化，豐富的膠原沉積伴膠原構型紊亂可導致增生性瘢痕形成。膠原本身是一種硬蛋白，無活動能力，占體內蛋白總量的25%，占皮膚干重的70%，是結締組織的主要成分。膠原的產生是創傷修復過程的高峰，也是瘢痕形成過程的決定性因素。膠原降解主要是膠原酶降解，研究證實增生性瘢痕成纖維細胞膠原酶活性明顯低于正常成纖維細胞［1］。膠原酶家族中基質金屬蛋白酶-2 (MMP-2，又稱明膠酶A)、基質金屬蛋白酶-9(MMP-9，又稱明膠酶B)逐漸成為研究熱點。本實驗主要研究水蛭素對增生性瘢痕組織MMP-2、MMP-9表達的作用及可能機制。

1 資料與方法

1.1 標本來源 臨床標本來自2011年4～8月在我院燒傷整形科手術切除的增生性瘢痕組織，其中男7例、女5例。手術室切取增生性瘢痕組織標本均取得患者或家屬同意。

1.2 實驗材料 胎牛血清(FBS，杭州四季青生物公司);DMEM培養基(Hyclone公司);MMP-2、MMP-9酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(上海鑫樂生物科技有限公司);水蛭素(武漢圣天宇科技有限公司);倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司);全自動酶標儀(美國伯樂公司)。

1.3 成纖維細胞的培養 成纖維細胞來自增生性瘢痕組織，采用組織塊法培養。將臨床標本在無菌條件下清洗消毒后切成0.5～1 mm3的組織塊，種植于培養瓶內。置于37℃、5%CO2培養箱靜置培養2～4 h后輕輕翻轉，加入含20%FBS的DMEM培養。每周換液2～3次，待原代細胞長滿瓶底70%時消化傳代，本實驗選用第4～5代細胞。

1.4 實驗分組 分為4組:對照組(無水蛭素)，水蛭素0.5 U/mL組，水蛭素1 U/mL組，水蛭素2 U/ mL組。

1.5 水蛭素作用樣品提取 選取生長狀態良好的細胞消化，不含FBS的DMEM培養液制成密度為2.5×104的單細胞懸液，接種于96孔板。37℃、5%CO2培養箱培養24 h后實驗組分別加入0.5、1、2 U/mL的水蛭素藥液，對照組加入等量的DMEM培養液。培養觀察48 h。收集培養液于無菌EP管中，2 000 r/min離心20 min，去除沉淀取上清液凍存備用。

1.6 ELISA法測定MMP-2、MMP-9的表達 采用雙抗體夾心ABC法。將120 μL的原倍標準品進行倍比稀釋。標準品孔中加入標準品50 μL、鏈霉素-HRP 50 μL;空白孔中只加入顯色劑A和B及終止液;待測樣品孔中加入樣品40 μL，HRP標記抗MMP-2、MMP-9抗體10 μL，鏈霉親和素-HRP 50 μL。37℃溫育60 min。洗滌拍干后加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，震蕩混勻，37℃避光反應15 min。每孔加終止液50 μL終止反應。空白孔調零，450 nm波長處測定吸光度值(OD)。繪制標準曲線計算MMP-2、MMP-9表達含量。

1.7 統計學方法 采用SPSS13.0軟件進行統計分析，實驗數據以s表示，組間比較采用t檢驗，以P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 增生性瘢痕成纖維細胞形態學觀察 成纖維細胞在培養后第5～7天從組織塊爬出，貼壁生長，細胞呈梭形，胞體飽滿，細胞排列呈一定弧度。水蛭素作用后細胞開始變圓，細胞間隙增大，數量減少。

2.2 水蛭素對增生性瘢痕成纖維細胞分泌MMP-2、MMP-9的影響 水蛭素能夠升高MMP-2、MMP-9的表達，0.5、1、2 U/mL水蛭素組中MMP-2、MMP-9含量均高于對照組，分別以0.5 U/mL組和1 U/mL組作用最明顯，但兩濃度組間比較差異無統計學意義。見表1。

3 討論

增生性瘢痕的形成是一個復雜的病理過程，多種細胞因子參與其發生和發展，近年來研究多認為其發生機理是成纖維細胞過度增殖為主的細胞基質降解失衡、過度沉積及細胞因子大量產生［2］，但血管內皮細胞的分化、增殖及新血管的形成等因素都影響著增生性瘢痕的形成［3］。保持基質合成與降解之間的平衡對完成組織修復有重要作用，且細胞外基質蛋白水解是組織修復和重建中的關鍵過程。而MMPs是細胞基質降解的關鍵成分，尤其以MMP-2、MMP-9是膠原降解的關鍵酶［4］。MMP-2、MMP-9分別被稱為72 kD-Ⅳ型膠原酶和92 kD-Ⅳ型膠原酶，共同作用底物是Ⅳ型膠原，但MMP-2作用更廣泛，還可以降解V、VII型膠原、彈性蛋白、纖維粘連蛋白及蛋白多糖中的蛋白核心。兩種MMPs主要由成纖維細胞、角質形成細胞、內皮細胞等合成和分泌，參與成纖維細胞，內皮細胞等的遷移、分化及新生血管形成［5］。Oikarinen采用原位雜交技術發現MMP-9主要表達于表皮細胞中，出現在創面愈合早期，參與創面愈合;MMP-2主要表達成纖維細胞中，出現在創面晚期，參與組織重塑。MMP-2和MMP-9可以分解多種基質，還是腫瘤細胞侵襲性的標志。

表1 水蛭素對增生性瘢痕成纖維細胞MMP-2、MMP-9表達的影響(ng/mL，s)

表1 水蛭素對增生性瘢痕成纖維細胞MMP-2、MMP-9表達的影響(ng/mL，s)

注:與對照組比較，*P＜0.05;與2 U/mL組比較，△P＜0.05

對照組15.179 9±12.863 9 9441.000 0±837.996 3水蛭素0.5 U/mL 55.915 3±12.005 5＊△ 11293.500 0±2593.8550＊△水蛭素1 U/mL 46.365 1±16.083 4＊△ 11709.000 0±461.827 3＊△水蛭素2 U/mL 39.793 7±4.000 3* 10367.000 0±663.429 6*

水蛭是一味傳統中藥，中醫用于治療血瘀經閉和跌打損傷。水蛭素是醫用水蛭中分離純化的一種多肽，能夠與凝血酶活性位點結合，形成非共價復合物發揮抗凝作用，是目前已知的活性最強的凝血酶特異性抑制劑。今年來研究發現水蛭素有抑制增生的作用［6］。張博等［7］發現復方水蛭素對小鼠移植瘤有顯著抑制作用;楊影等［8］研究證實水蛭素對體外培養鞏膜成纖維細胞及細胞外基質有抑制作用;李璇等［9］發現水蛭素能夠抑制成纖維細胞增殖，抑制I、Ⅲ型前膠原mRNA的表達。但關于水蛭素對成纖維細胞分泌MMP-2、MMP-9有何作用的報道較少見。本實驗證實，通過體外培養增生性瘢痕成纖維細胞，發現0.5、1、2 U/mL水蛭素能夠促進MMP-2、MMP-9的表達，二者表達含量上升，高于對照組。0.5 U/mL水蛭素對MMP-2作用最明顯，1 U/mL水蛭素對MMP-9作用最明顯。MMP-2、MMP-9是降解瘢痕組織中細胞外基質的主要因素，加入水蛭素后MMP-2、MMP-9的表達含量增加，說明水蛭素能夠促進二者基因表達而發揮分解膠原的作用。水蛭素通過促進MMPs表達減輕細胞外基質沉積而減輕瘢痕增生和攣縮，有抑制瘢痕增生的作用。

細胞外基質在創傷修復中具有重要作用，基質代謝平衡失調與增生性瘢痕的形成有緊密關聯［10］，MMPs是起主要降解作用的膠原酶。本實驗發現水蛭素能夠提高MMP-2、MMP-9的表達減輕細胞基質沉積，為進一步研究水蛭素應用治療增生性瘢痕機制提供了思路。MMP-2和MMP-9與其抑制因子在創面愈合轉歸中的關系逐漸成為研究熱點，水蛭素對其抑制因子的作用需要進一步研究。

［1］Ghahary A，Shen YJ，Nedelec B，et al.Collgenase production is lower in post-burn hypertrophic scar fibroblast than in normal fibroblasts and is reduced by insulin-like-growth factor［J］.J Invest Dermatol，1996，106(3):476-481.

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［3］陳偉，付小兵，孫同柱，等.增生性瘢痕組織中轉化生長因子-β異構體與受體含量變化及對瘢痕形成的影響［J］.中國修復重建外科雜志，2002，16(4):252-256.

［4］蔡景龍.現代瘢痕學［M］.北京:人民衛生出版社，2008: 143-148.

［5］王志，顧正平，張建忠，等.基質金屬蛋白酶-2，9及其抑制因子在增生性瘢痕中的表達特征及意義［J］.武警醫學，2008，19 (3):235-239.

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［7］張博，王曉敏，任青華，等.復方水蛭素對小鼠移植瘤組織中p53、Ki-67及VEGF表達的影［J］.山東醫藥，2008，48(43): 29-30.

［8］楊影，鄭燕林，王明芳，等.水蛭素對體外培養的成纖維細胞生長的影響［J］.眼科，2004，13(5):300-302.

［9］李璇，劉達恩，張國佑，等.水蛭素抑制體外模擬增生性瘢痕模型的實驗研究［J］.中華中醫藥雜志，2009，24(7):929-931.

［10］Gailit J，Clark RA.Wound repair in the context of extracellular matrix［J］.Curr Opin Cell Biol，1994，6(5):717-725.