鹽生植物小花堿茅外整流K┼通道SKOR基因片段的克隆及序列分析

王 茜，王 沛，王鎖民

(蘭州大學草地農業科技學院 草地農業系統國家重點實驗室，甘肅 蘭州 730020)

Na+是廣泛存在于土壤以及土壤溶液中的元素。但是，不論甜土植物還是鹽生植物，其細胞質酶都對Na+有高度的敏感性[1-3]。過量的Na+會對植物生長產生各種不利影響，甚至導致植物死亡[4]。鹽生植物在進化過程中，形成了特殊的耐鹽機制，對其耐鹽機理研究以及耐鹽相關功能基因的挖掘在農作物和優良牧草耐鹽性的遺傳改良方面有十分重要的應用價值。

小花堿茅(Puccinelliatenuiflora)為禾本科堿茅屬多年生牧草，耐鹽堿，能夠在高濃度的Na+環境下維持體內很低的Na+水平[5-8]。Wang等[9]的研究發現，小花堿茅具有極強的K+/Na+選擇性運輸能力，從而能夠在鹽脅迫下維持地上部穩定的高K+含量，可見，限制Na+內流，同時提高地上部K+的積累，進而維持植株體內高的K+/Na+是增強植物耐鹽性的關鍵[10]。研究表明，K+在植物地上部的積累主要是通過將根部吸收的K+經木質部裝載，在蒸騰拉力作用下，隨木質部流進入地上部完成的，外整流K+通道在此運輸過程中發揮重要作用[11]。

外整流K+通道屬于Shaker通道家族，目前針對它的研究涉及甚少。Wegner和Raschke[12]通過膜片鉗技術在大麥(Hordeumvulgare)根離體的木質部薄壁細胞的原生質體中首次發現了外整流K+通道的活性，將其稱為KORC(K+-selective Outwardly Rectifying Conductance)。隨后，在玉米(Zeamays)根皮層及中柱細胞中也檢測到了外整流K+通道，并確定其介導K+從中柱細胞外排到木質部汁液中[13-14]，這一功能在大麥中也得到了驗證[13]。Gaymard等[11]從擬南芥(Arabidopsisthaliana)中首次克隆到編碼外整流K+通道的基因，并發現其在根中柱組織特異表達，且能被ABA抑制，將其命名為SKOR(Stelar K+Outward Rectifier)，在突變體中的研究也證實了SKOR的上述功能。由此猜測，在小花堿茅體內，外整流K+通道SKOR可能在維持其體內高的K+/Na+，進而在提高植株耐鹽性中發揮重要作用。本研究采用RT-PCR方法克隆拒鹽型鹽生植物小花堿茅SKOR基因片段并分析其序列特征，以期為小花堿茅SKOR基因全長的克隆、表達調控、RNAi等研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1試驗材料 植物材料為4周齡小花堿茅幼苗，種子采自甘肅省張掖市臨澤縣。大腸桿菌DH5α菌株為草地農業系統國家重點實驗室保存。

1.2研究方法

1.2.1材料培養 參照王生銀等[15]的方法。挑選籽粒飽滿的小花堿茅種子播種在鋪有吸水紙的篩網架上，然后置于白瓷盤中暗培養，25 ℃，澆蒸餾水發芽，約7 d后澆灌Hoagland營養液(5 mmol·L-1KNO3，0.5 mmol·L-1NH4H2PO4，0.25 mmol·L-1MgSO4·7H2O，1.5 mmol·L-1Ca(NO3)2·4H2O，0.5 mmol·L-1Fe-citrate，92 μmol·L-1H3BO3，18 μmol·L-1MnCl2·4H2O，1.6 μmol·L-1ZnSO4·7H2O，0.6 μmol·L-1CuSO4·5H2O，0.7 μmol·L-1(NH4)6Mo7O24·4H2O )。營養液約5 d更換一次。培養室晝/夜溫度為(28±2) ℃/(23±2) ℃，光照16 h·d-1，光強約為600 μmol·m-2·s-1，空氣相對濕度為60%～80%。

1.2.2總RNA的提取 參照王生銀等[15]的方法。將4周齡小花堿茅幼苗經25 mmol·L-1NaCl與10 mmol·L-1KCl處理48 h，取其根系，加入液氮研磨至粉末狀，按照UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒的操作說明書提取根系總RNA。用1.0%甲醛變性凝膠電泳鑒定其完整性和質量。

1.2.3引物的設計與合成 參照王生銀等[15]的方法。通過對其他植物SKOR核苷酸序列進行同源性比較，找出高度保守的區段，根據同源性高和簡并性低的原則，利用DNAMAN和Primer 5.0軟件設計一對簡并性引物P1和P2，用于擴增小花堿茅SKOR基因片段，推測目的片段的長度為566 bp，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

P1：5′-TACCTG(A/G)TCGG(C/G)AACATGACGGCG-3′；

P2：5′-GATGCT(A/G)GTCA(A/G)GGA(C/T/U)TGCTTGTC-3′。

1.2.4RT-PCR擴增 參照王生銀等[15]的方法。PCR擴增反應體系：在200 μL PCR管中依次加入10×PCR Buffer 5 μL、25 mmol·L-1MgCl23 μL、2 mmol·L-1dNTP 5 μL、10 μmol·L-1P11 μL、10 μmol·L-1P21 μL、5 U·μL-1Taq DNA polymerase 0.5 μL、cDNA 4 μL，加純水至50 μL。反應條件：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s、56 ℃退火50 s、72 ℃延伸60 s，30個循環；最后72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物用1.2%瓊脂糖凝膠檢測，目的片段的回收和純化按照UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒操作說明進行。

1.2.5陽性克隆的篩選與鑒定 參照王生銀等[15]的方法。將回收的PCR產物連接到pUCm-T載體，轉化感受態大腸桿菌DH5α，用含有50 μg·mL-1氨芐青霉素的LB固體培養基進行藍白斑篩選，轉化白斑菌株經質粒PCR鑒定確認陽性克隆后，送至北京華大基因科技股份有限公司測序。

1.2.6序列分析 參照王生銀等[15]的方法。序列的比較、翻譯等在DNAMAN生物軟件上進行，Blast搜索在NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)網站上進行。

2 結果

2.1RT-PCR擴增 以總RNA反轉錄所得到的第一鏈cDNA為模板，用SKOR基因的簡并性引物P1和P2進行PCR擴增(圖1)。擴增產物經凝膠電泳檢測發現約在560 bp處有一條亮帶，且上下無雜帶，與目的片段的大小一致，推測可能是小花堿茅SKOR基因片段。

圖1 RT-PCR產物凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of RT-PCR products

圖2 陽性克隆的PCR鑒定Fig.2 PCR identification of positive clones

2.2陽性克隆的鑒定 將回收純化的目的片段連接到pUCm-T克隆載體上，轉化大腸桿菌DH5α。從轉化的平板上隨機挑取4個白色菌斑并提取質粒，進行PCR擴增，得到的擴增片段大小約為560 bp(圖2)，與RT-PCR結果一致，表明這些克隆為陽性克隆。

2.3SKOR基因片段序列分析 測序結果顯示，該陽性克隆序列長度為555 bp，推測其編碼185個氨基酸(圖3)。Blast 比較結果表明，該片段與玉米(AY899 922.1)、擬南芥(NM_111 153.3)、葡萄(Vitisvinifera)(AJ490 336)、蓖麻(Ricinuscommunis)(XM_002 533 405)和胡楊(Populuseuph-ratica)(EU382 997.1)等植物外整流K+通道基因的核苷酸序列的同源性均在66%以上，與禾本科模式植物水稻(Oryzasativa)推測的外整流K+通道基因的(GQ355 585.1)核苷酸序列的同源性最高，達到82%。表明本研究克隆到的片段為外整流K+通道基因片段，將其命名為PtSKOR。

圖3 小花堿茅PtSKOR核苷酸序列及推測的氨基酸序列Fig.3 Nucleotide and deduced amino acid sequence of PtSKOR fragment from Puccinellia tenuiflora

多重比較及系統進化分析表明，小花堿茅PtSKOR片段與禾本科植物水稻推測的外整流K+通道OsSKOR(ADF28 806.1)的進化關系非常近，氨基酸同源性高達83%；與其他單子葉植物如玉米ZKOR(AM746 987.1)的進化關系相對較遠，同源性為61%；與雙子葉植物如擬南芥AtSKOR(NP_186 934.1)、葡萄VvSOR(CAD35 400.1)、胡楊PeORK(ABY86 890.1)、蓖麻RcSKOR(XP_002 533 451.1)等同源性分別為61%、60%、55%和55%(圖4、圖5)。序列比對及疏水性分析表明，本研究得到的小花堿茅PtSKOR片段的氨基酸序列起始于最后一個跨膜區(S6)中段，與非跨膜區相比，該跨膜區在結構上高度保守(圖3、圖4)。

圖4 PtSKOR氨基酸序列與其他植物SKOR氨基酸序列的多重比較Fig.4 Amino acid sequence alignment of PtSKOR with those from other plants

圖5 PtSKOR蛋白質序列與其他植物外整流K+通道的系統進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of PtSKOR and outward rectifier K+ channel from other plants

3 討論

長期以來，有關外整流K+通道蛋白的研究主要集中在模式植物擬南芥上。科學家們在擬南芥中提出的假說認為，鹽脅迫下，隨著木質部薄壁細胞中Na+不斷積累，引起薄壁細胞質膜去極化，激活外整流K+通道蛋白(SKOR)或非選擇性離子外整流通道蛋白(NOR)活性，進而將K+裝載到木質部向地上部運輸[14，16]。Gaymard等[11]從擬南芥中分離到K+外整流通道蛋白基因AtSKOR，通過非洲爪蟾卵母細胞(Xenopusoocytes)異源表達和突變體atskor試驗證明，AtSKOR介導K+從木質部薄壁細胞向木質部的裝載。可見，SKOR在植物地上部K+積累方面的作用不容忽視。Wang等[9]在拒鹽牧草小花堿茅中的研究證明，其地上部K+的含量不受外界鹽分濃度及處理時間的影響，并維持植株地上部高的K+/Na+。由此推測，小花堿茅PtSKOR作為外整流K+通道，對其耐鹽性發揮著重要作用。

本研究得到的PtSKOR片段與擬南芥、葡萄、胡楊、蓖麻等雙子葉植物的外整流K+通道相比同源性較低，介于55%～61%；與單子葉植物水稻推測的外整流K+通道OsSKOR同源性達到83%，但與其內整流K+通道AKT1同源性僅為33%(圖5)，因此推測此通道為小花堿茅外整流K+通道。PtSKOR與玉米ZORK同源性卻僅有61%，這可能是由于玉米ZORK基因主要表達于根外皮層及保衛細胞中[17]，與已知的其他植物的外整流K+通道分屬不同類。

植物外整流K+通道SKOR結構與KAT1、AKT1等內整流K+通道類似，具有6個疏水性跨膜區域(S1～S6)[11]。本試驗克隆獲得的PtSKOR片段起始于最后一個跨膜區(S6)中段。S6跨膜區及其細胞內擴展區域具有高度的序列保守性(圖4)，與通道阻斷劑的相互作用是K+通道電壓門控的重要機制[18]。此外，PtSKOR與已報道的AtSKOR一致，在近C端含有環核苷酸結合序列(Cyclin Nucleotide-Binding Site,CNBS)，與環核苷酸的調控有關[19]。然而，各類K+通道在C端的結構差異較大，如KAT1與SKOR在跨膜區具有很高的同源性，但C端比SKOR少約200個氨基酸及6個錨蛋白重復基序(Ankyrin Repeat Motif,AR)[20-21]。因此，KAT1對于細胞內的K+沒有響應，而SKOR的C端非跨膜區對于其感受細胞內K+信號起著關鍵作用。可見，PtSKOR基因的研究為闡明鹽生植物小花堿茅K+、Na+選擇性運輸機制提供分子層面的依據，對于改良作物耐鹽堿性奠定了理論基礎。

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