綠葉汁發酵液為添加劑改善玉米青貯品質的研究

嚴 萍，張永輝，麥熱姆妮薩·艾麥爾，阿不都克尤木·買買提，烏斯滿·依米提

(新疆大學生命科學與技術學院,新疆 烏魯木齊 830046)

青貯是以新鮮的青飼料為原料，在密閉條件下，利用植物表面自然附生的乳酸菌，通過厭氧發酵，將植物表面的可溶性碳水化合物轉化為乳酸、乙酸等有機酸，使飼料pH值降低，來抑制霉菌、酵母菌、梭狀芽孢桿菌等腐敗微生物的生長繁殖，通過青貯可以達到保持青飼料營養特性的目的[1-2]。傳統青貯方法以粗鹽為添加劑，采用這種方法制得的青貯飼料品質不佳。

改善青貯發酵品質方面所利用的添加劑種類較多。目前在各國普遍采用的添加劑有甲酸、乳酸菌制劑和乳酸菌制劑與酶制劑的混合物等。通常認為促進青貯發酵的乳酸菌為原料上附著的野生乳酸菌，數量很少，尤其在青貯發酵過程中起重要作用的乳酸桿菌數量極少[3]。綠葉汁發酵液是通過發酵，大量增殖原料表面附著的野生乳酸菌，從而使青貯發酵效果更好[4-6]。

新疆是我國最大的牧區之一，冬季漫長，草地沙漠化嚴重。草地的沙漠化及飼料的季節供應不足制約著畜牧業的發展，青貯工藝可以在很大程度上改善這種制約。本研究采用綠葉汁發酵液作為青貯添加劑來制作青貯飼料，并測定其發酵品質，就是建立在新疆特殊氣候條件下，可以極大改善青貯飼料發酵品質和消化率的發酵工藝。

1 材料與方法

1.1材料 青貯原料為2009年10月采自新疆吐魯番地區的蠟熟期收獲的飼料玉米(Zeamays)(新疆飼料玉米一號)；MRS固體培養基用于乳酸菌的計數；牛肉膏蛋白胨培養基用于細菌的計數；馬丁氏培養基用于真菌的計數。

1.2儀器與設備 高壓滅菌鍋(上海博迅公司生產)，GXZ型智能光照培養箱(寧波江南儀器廠生產)，JD200-3 型電子天平(沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司生產)，SWCJ-1F 型超凈工作臺(江蘇蘇凈安泰空氣技術有限公司生產)，哈納酸度離子計pH211(北京哈納科儀科技有限公司生產)，LC-20AD Prominence 島津高效液相色譜儀(島津國際貿易上海有限公司生產)及凱氏定氮儀。

1.3綠葉汁發酵液的制備 稱取新鮮飼料玉米樣品(經過切割混勻，長度約為2 cm)200 g，置于1 000 mL 2%的葡萄糖溶液中，每隔4 h測一次OD660 nm值，連續測48 h，繪制乳酸菌生長曲線圖，得到綠葉汁發酵液菌落穩定期時間，重復稱取飼料玉米樣品200 g，置于1 000 mL 2%葡萄糖溶液中，待菌落達到穩定期后，過濾備用。

1.4青貯飼料的制作 提前處理飼料樣品，長度為2～5 cm。按表1的處理方式制作青貯飼料，裝于廣口塑料瓶中(裝填量要保證瓶中基本無空氣)。每個處理做3個重復[7-8]。

表1 青貯飼料處理方式

1.5青貯飼料菌落分布 稱取經過切割混勻，長度約為2 cm的青貯飼料樣品20 g ，置于裝有180 mL無菌水的三角瓶中，震蕩30 min后，吸取菌液進行10倍梯度稀釋，得到10-4、10-5、10-63個稀釋度。在細菌培養基、MRS固體培養基和馬丁氏培養基上涂布。30 ℃培養48 h后，用菌落計數法計數[9]。

1.6青貯飼料品質鑒定 采用烘干法測定干物質(DM)，即真空干燥箱105 ℃恒溫干燥，稱量；稱取青貯飼料50 g，加450 mL蒸餾水粉碎后，經8層紗布過濾，用哈納酸度離子計測定濾液pH值；采用范式洗滌纖維法測定中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)和酸性洗滌木質素(ADL)；采用凱氏定氮法測定粗蛋白(CP)含量[10]。揮發性脂肪酸采用高效液相色譜法測定[11-15]；消化率采用模擬瘤胃消化試驗法測定，模擬飼料在瘤胃和皺胃中的消化。采集成年健康羊的胃液，經澄清過濾后，與緩沖液(緩沖液配方為碳酸氫鈉 9.8 g·L-1、磷酸氫二鈉9.3 g·L-1、氯化鈉0.47 g·L-1、氯化鉀0.57 g·L-1、尿素1 g·L-1、氯化鈣0.04 g·L-1、氯化鎂0.06 g·L-1)以1∶1的體積比混勻(混合前，緩沖液在38 ℃下預熱)。稱取干燥粉碎樣品(過40目)2.000 g放入消化瓶中，在38 ℃下預熱。向消化瓶中加入50 mL配好的消化液，搖動混合，通入氮氣。密封，將消化瓶放入38 ℃培養箱中培養48 h。每6 h測一次產氣量。測定其干物質、酸性洗滌纖維、中性洗滌纖維及粗蛋白消化率[15-17]。

1.7統計分析 試驗數據采用SPSS 17.0進行單因素方差分析。

2 結果

2.1青貯原料的化學成分及微生物數量 青貯前先對青貯原料的化學成分微生物數量進行分析，干物質含量72%，pH值7.6，CP、NDF、ADF和ADL含量分別為13.5%、52%、27%和24%，乳酸菌、細菌和真菌數量分別為3.6×103、7.5×107和1.4×107cfu·g-1。

2.2綠葉汁發酵液中乳酸菌生長曲線 青飼料在碳源(葡萄糖)充足的狀態下，乳酸菌經過24 h達到穩定期，經菌落計數法測定，綠葉汁發酵液中乳酸菌數量達到2.49×107cfu·mL-1(圖1)。取此時的綠葉汁發酵液作添加劑菌體量最大，可以達到最好的效果。

2.3青貯飼料菌落分布 飼料經過青貯后乳酸菌數量明顯增加，由原料中3.6×103cfu·g-1增加為(2.53×105～3.47×106)cfu·g-1，而細菌和真菌的數量都減少了2個數量級(表2)。說明青貯后，乳酸菌大量繁殖，產生較多乳酸，從而抑制了細菌和真菌的生長繁殖。添加綠葉汁發酵液后，乳酸菌菌落數較對照組及傳統方法組多一個數量級，說明添加綠葉汁發酵液可以增加乳酸菌菌落數，更有利于青貯過程的進行。

表2 青貯飼料菌落分布

2.4青貯飼料品質分析結果 經過青貯后，飼料pH值均由7.6降為5.0以下，處理組pH值均顯著低于對照組(P<0.05)；添加綠葉汁發酵液與傳統加鹽方法相比pH值也顯著降低(表3)。除添加1.0%發酵液3% NaCl處理外，其他處理組乳酸含量均顯著高于對照組，且添加1.5%和2.0%綠葉汁發酵液的青貯飼料乳酸含量顯著高于傳統加鹽組。傳統加鹽組、添加1.0%發酵液與對照組乙酸含量無顯著性差異(P>0.05)，添加1.5%和2.0%綠葉汁發酵液組顯著高于與對照組和傳統加鹽組。除添加1.0%發酵液和3% NaCl處理組外，其余處理組總酸含量均顯著高于對照組，且添加1.5%和2.0%綠葉汁發酵液組顯著高于傳統加鹽組(表3)。

2.5青貯飼料化學成分 經過青貯后，飼料干物質量、CP含量有所增加。發酵液處理組干物質含量顯著高于對照組與加鹽組(P<0.05);加鹽組干物質含量均與對照組差異不顯著(P>0.05)；1.0%發酵液處理組CP含量顯著高于對照組，3% NaCl組顯著低于對照組，其余各組與對照無顯著差異，各發酵液組的ADF含量及NDF含量與對照組相比，顯著低于對照組；添加1.5%、2.0%發酵液處理組NDF含量顯著低于對照；除2.0%發酵液和1% NaCl處理組ADL含量顯著低于對照組外，其余各處理組均與對照組無顯著差異(表4)。

2.6體外消化率結果 除3% NaCl處理組外，其他處理組NDF、ADF消化率均顯著高于對照組(P<0.05)；1.5%發酵液及1% NaCl處理組的CP消化率顯著高于對照組，1.0%發酵液、2.0%發酵液、3% NaCl差異不顯著(P>0.05)；處理組干物質消化率高于對照組，1.0%發酵液、1.5%發酵液、1% NaCl、3% NaCl與對照組相比差異不顯著(表5)。

表3 不同青貯處理對飼料發酵品質的影響

表4 不同青貯處理對飼料化學成分的影響

表5 不同青貯處理對體外消化率的影響

3 討論

新疆畜牧業發展的總體目標是大力發展牛、羊等草食家畜，逐步形成一個“節糧型” 畜牧業結構。從我國農業整體發展戰略考慮，發展草食家畜主要依靠農區，飼用玉米種植面積在近10年內將會發展到全疆玉米種植面積的15%～20%[18]。飼料玉米具有高產、多汁清香，適口性好、纖維素含量低、利于消化等優點。但飼料玉米碳水化合物含量較少，未能滿足優質青貯飼料所需的8%～10%含量[19],本研究通過添加葡萄糖來提高碳水化合物含量，以保證青貯過程順利進行。一般情況下，植物體表面附著乳酸菌數量不足，主要是異型發酵乳酸菌，同時包括大量不良菌種(霉菌、酵母菌和丁酸菌)。若乳酸菌數量不足，青貯初期乳酸菌繁殖緩慢，不能有效抑制有害微生物增殖，要使乳酸菌快速繁殖并占據優勢地位，理論上要求每克青貯飼料上附著的乳酸菌菌落數必需在105個以上[20]。本研究通過添加綠葉汁發酵液使乳酸菌數量達到要求數量，保證青貯初期發酵所需足夠的乳酸菌數量，通過乳酸菌發酵產生大量乳酸降低pH值，抑制有害微生物的生長繁殖，保持青飼料的營養價值。

徐慶方等[21]研究結果表明，添加綠葉汁發酵液青貯后，pH值降低至4.32以下，乳酸含量增加至6.26%。經品質測定結果可知，在添加綠葉汁發酵液及葡萄糖后，青貯飼料的發酵品質比對照組及傳統青貯方法組有明顯改善，pH值降低至4.0以下，乳酸、乙酸含量增加，特別是添加2.0%乳酸菌發酵液組pH值低于3.5以下。有害菌數量減少，乳酸菌數量增加至3.47×106cfu·g-1，干物質含量、粗蛋白含量以及有機酸含量都有較大程度的提高。

通過試驗結果初步確定了綠葉汁發酵液的最佳添加濃度，同時進一步了解到綠葉汁發酵液可以提高青貯飼料干物質、粗蛋白、中性洗滌纖維素及酸性洗滌纖維素消化率，比起傳統青貯方法，添加綠葉汁發酵液可以改善青貯品質，抑制有害微生物的繁殖，減少營養物質的流失，提高干物質，粗蛋白和纖維素的消化率，從而提高青貯飼料利用率，緩解飼料季節性供應不足的問題。本研究為生產高品質青貯飼料技術提供一定的理論和科學依據。

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