野豌豆屬4個品種(系)的染色體核型

管 超，張吉宇，王彥榮，聶 斌

(草地農業生態系統國家重點實驗室 蘭州大學草地農業科技學院，甘肅 蘭州 730020)

春箭筈豌豆(Viciasativa)是豆科(Leguminosae)野豌豆屬(Vicia)一年生或越年生草本植物。普遍種植于我國長江中下游、華北和西北諸省區[1]。耐干旱、耐貧瘠，不耐鹽堿和水漬，喜冷涼氣候，宜早春和晚秋生長，與其他作物間種或套種時有一定的耐陰性。莖枝柔嫩、葉量多，適口性好、營養價值高，是優良的綠肥、飼草和糧食兼用作物[2]。

自1998 年以來，蘭州大學草地農業科技學院以早熟、高產為指標，開展了春箭筈豌豆品種選育[3]，至今已成功培育出品種“蘭箭3號”、品系2556和2560。這3個品種(系)的農藝學性狀均具有一定的差異[4]，存在基因型與環境穩定互作[5]。目前國內外學者已在狹葉野豌豆(V.angustifolia)[6-7]、廣布野豌豆(V.cracca)[8]、山野豌豆(V.amoena)[9]及褐毛野豌豆(V.pannonica)[10]等多種野豌豆屬植物中開展過染色體核型研究，但在春箭筈豌豆中的研究僅見于兩個亞種V.sativasubsp.sativa和V.sativasubsp.nigra[11]。已有關于春箭筈豌豆種子顏色遺傳[12]和細胞遺傳學[13]的相關研究，但關于春箭筈豌豆不同品種(系)間染色體遺傳多樣性的研究鮮見報道。鑒于此，本研究對不同品種(系)的春箭筈豌豆進行染色體核型分析，深入探究不同品種(系)春箭筈豌豆的染色體核型特征和染色體遺傳多樣性，以期為利用染色體資料指導植物同源染色體加倍、種屬間雜交、人工異源多倍體合成等技術改良或培育植物新品種提供細胞學和遺傳學依據。

1 材料與方法

1.1材料及來源 供試材料包括蘭州大學草地農業科技學院選育的春箭筈豌豆品種“蘭箭3號”，品系2556、2560，甘肅省廣為種植的狹葉野豌豆品種333/A作為對照。春箭筈豌豆品種(系)種子為蘭州大學草地農業科技學院生產，333/A由中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所提供。

1.2方法 將成熟的野豌豆屬種子放入培養皿中，加適量的水置于25 °C培養箱內生根，待幼根長約1 cm時于09：00-10：00取材；采用低溫預處理的方法[14]，在4 °C條件下處理24 h；預處理后的幼根于卡諾液(無水乙醇∶冰乙酸=3∶1)中固定20～24 h；固定后的幼根用去離子水反復沖洗后，放入1 mol·L-1的鹽酸中，在60 °C下解離10 min；經解離的幼根用去離子水反復沖洗，再用改良的石炭酸品紅染液染色0.5～2 h后壓片，用普通光學顯微鏡(Leica，Germany)鏡檢；對所得圖像用Photoshop 5.0進行處理分析。核型分析采用李懋學和陳瑞陽[15]的染色體分類標準，核型不對稱系數(As.K，%)按Arano[16]的方法計算，核型不對稱性采用Stebbins[17]的分類標準。每個品種(系)均選取16個細胞(4個根尖個體，每個根尖中選取4個細胞)，計算平均值。

2 結果與分析

2.1染色體核型分析 對染色體分散良好的細胞進行觀察，并進行染色體數目統計(表1)。野豌豆屬4個品種(系)的染色體數目均為2n=2x=12，二倍體，染色體基數為x=6。4個不同品種(系)的染色體核型參數見表2，染色體形態、核型圖和核型模式圖(Idiogram)見圖1。蘭箭3號的染色體數為2n=12，核型公式為2n=2x=8m+2sm+2st，在6對染色體中，第1、2、4、5對染色體為中部著絲點區染色體(m)，第3對染色體為近中部著絲點區染色體(sm)，第6對染色體為近端部著絲點區染色體(st)，未觀察到次縊痕和隨體；品系2556、2560的染色體數為2n=12，核型公式為2n=2x=10m+2sm，在6對染色體中，第1～5對染色體均為中部著絲點區染色體(m)，第6對染色體為近中部著絲點區染色體(sm)，未觀察到次縊痕和隨體；品種333/A的染色體數為2n=12，核型公式為2n=2x=2m+8sm (2SAT)+2st，在6對染色體中，第1、2、3、5對染色體均為近中部著絲點區染色體(sm)，第4對染色體為中部著絲點區染色體(m)，第6對染色體為近端部著絲點區染色體(st)，在3號染色體上的長臂端觀察到有1個隨體存在。

表1 野豌豆屬4個品種(系)的染色體數目統計Table 1 Number of chromosomes in four Vicia varieties (lines)

2.2野豌豆屬不同品種(系)的核型參數比較 根據Stebbins[17]的染色體核型分析和核型進化方法，計算染色體長度比及染色體臂比大于2∶1的染色體所占百分比，由此判斷染色體核型類型。對4個品種(系)的核型參數進行比較(表3)，結果顯示，雖然4個品種(系)的染色體數目相同，但其核型公式、染色體總長度、長度范圍、核型類型均不相同。蘭箭3號和品種333/A的染色體總長度分別為41.95和50.55 μm，而品系2556和2560的染色體總長度分別為44.11和43.07 μm。蘭箭3號和品種333/A的染色體絕對長度范圍分別為1.84～4.78和2.44～5.68 μm，而品系2556和2560的染色體絕對長度范圍分別為1.71～5.21和2.02～5.10 μm。蘭箭3號的染色體的長度比為2.60，臂比>2∶1的染色體占17%，故核型類型為“2B”；品系2556的染色體的長度比為3.04，臂比>2∶1的染色體占17%，故核型類型為“2B”；品系2560的染色體長度比為2.52，不存在臂比>2∶1的染色體，故核型類型為“1B”；品種333/A的染色體的長度比為2.33，臂比>2∶`1的染色體占83%，故核型類型為“3B”。蘭箭3號、品系2556、品系2560和品種333/A的核型不對稱系數分別為58.64%、58.49%、58.97%和70.15%。

3 討論

根據Stebbins[17]的染色體核型分析方法，野豌豆屬4個品種(系)染色體核型有“1B”、“2B”和“3B”3種類型，表明這4個品種(系)在進化過程中處于較為進化的地位。野豌豆屬4個品種(系)的染色體數目相同，均為2n=2x=12，未發生染色體數目改變，Sevimay等[18]的研究發現，8個土耳其春箭筈豌豆品種的染色體數目均為2n=2x=12，Gaffarzade等[11]研究發現，春箭筈豌豆的亞種Viciasativasubsp.sativa和V.sativasubsp.nigra的染色體數目均為2n=2x=12，而毛野豌豆(V.villosa)的染色體數目為2n=2x=14，這表明在進化過程中野豌豆屬內植物發生了染色體數目的變異，而春箭筈豌豆未發生染色體數目變異。狹葉野豌豆品種333/A的核型特征與3種春箭筈豌豆的差異較大，其核型類型是相對最進化的。品系2556和2560的核型特征比較相近，二者核型公式相同，染色體總長度、長度范圍和核型不對稱系數都比較接近，但二者的核型類型不相同，其中品系2556較為進化。一個物種的核型特征即染色體數目、形態及行為的穩定是相對的，種內染色體的多態性是廣泛存在的現象，遺傳多樣性越豐富，物種進化的潛力就越大；對環境改變的適應能力越強，意味著物種自身的延續能力越強[19]。本研究和前人的研究結果共同表明，不同品種(系)春箭筈豌豆的核型特征存在著廣泛的差異，具有廣泛的遺傳多樣性，表明春箭筈豌豆這個物種在進化中具有很大的潛力。

表2 野豌豆屬4個品種(系)的染色體核型參數Table 2 Chromosomal parameters of four varieties (lines) of Vicia karyotype analyses

陳軍和高清祥[7]發現，春箭筈豌豆品種333和333/A的核型公式均為2n=2x=2m+6st(2SAT)+4t,王建波等[6]發現狹葉野豌豆的核型公式為2n=2x=2sm+10st(2SAT),Frediani等[20]發現春箭筈豌豆的核型公式為2n=2x=2m+6sm(2SAT)+4st,而本研究發現春箭筈豌豆“蘭箭3號”的核型公式為2n=2x=8m+2sm+2st，品種333/A的核型公式為2n=2x=2m+8sm(2SAT)+2st，品系2556和2560的核型公式均為2n=2x=10m+2sm。表明野豌豆屬不同品種(系)在進化中發生了染色體形態上的變異，具有染色體遺傳多樣性。根據Arano[16]關于核型進化的觀點，核型不對稱系數越大，染色體越不對稱，物種越進化。4個品種(系)的核型不對稱系數為品種333/A>品系2560>蘭箭3號>品系2556，所以說品種333/A是相對進化的。Stebbins[17]關于核型進化的分類標準為：“1A”型為最對稱型，“4C”型為最不對稱型，且核型比不對稱者較為進化。品種333/A的核型類型為“3B”，是較為進化的類型,“蘭箭3號”、品系2556的核型類型均為“2B”,品系2560的核型類型為“1B”，是較為原始的類型。陳軍和高清祥[7]發現春箭筈豌豆品種333和333/A的核型類型均為“3B”,Frediani等[20]發現春箭筈豌豆的核型類型為“3B”，這均與本研究中狹葉野豌豆品種333/A的核型類型一致,而王建波等[6]發現狹葉野豌豆的核型類型為“4B”。表明野豌豆屬在適應環境的過程中，產生了多種變異，經過長期的自然選擇，朝著更為適應環境的方向進化。

圖1 蘭箭3號(A1～A3)、品系2556 (B1～B3)、品系2560(C1～C3)和品種333/A(D1～D3)的染色體形態、核型圖和核型模式圖Fig.1 Morphology of somatic chromosomes and karyotypes, idiograms of V.sativa Lanjian No. 3 (A1-A3), V.sativa 2556 (B1-B3), V.sativa 2560(C1-C3) and V.angustifolia 333/A (D1-D3)

Alice等[10]發現春箭筈豌豆第2、3對染色體長臂端具隨體，Gaffarzade等[11]發現春箭筈豌豆的亞種V.sativasubsp.sativa第2、3對染色體長臂端具隨體，亞種V.sativasubsp.nigra第5對染色體長臂端具隨體,陳軍和高清祥[7]發現第3對染色體長臂端均具有隨體,而本研究發現狹葉野豌豆品種333/A第3對染色體長臂端具隨體，與前人的研究基本一致。另外，Alice等[10]還發現大花野豌豆(V.grandiflora)第2對染色體短臂端具隨體,褐毛野豌豆(V.pannonica)第1、2對染色體長臂端具隨體,法國豌豆(V.narbonensis)第4對染色體長臂端具隨體。從理論上講，無隨體的染色體核型是不能成立的，因為隨體和核仁組成區(NOR)并存，而沒有NOR的細胞是不能生存的[21]。本研究在蘭箭3號、品系2556和2560染色體的研究中未發現隨體，是由于隨體太小無法分辨，還是在制片過程中丟失，有待進一步的研究。另外，在Sevimay等[18]的研究中，8個土耳其春箭筈豌豆品種也均未發現隨體的存在。

表3 野豌豆屬不同品種(系)的核型參數比較Table 3 The karyotypic characters of different varieties (lines) Vicia

核型似近系數(Karyotype Resemblance-near Coefficient)是兩個物種在形態結構上等同程度的表征，它反映物種間在核型上的同源性或親緣關系的遠近。譚遠德和吳昌謀[22]于1993年提出了核型似近系數聚類分析。1996年吳昌謀[23]又將此分析方法進一步完善，提出了核型進化距離的概念及計算方法，2005年李峰和潘沈元[24]開發了可運行于PC機上的核型似近系數聚類分析軟件，這是一種根據核型似近系數的聚類分析方法，利用Visual Basic編制的核型似近系數的聚類分析軟件。因此，今后可以考慮采用核型似近系數分析軟件對不同品種(系)春箭筈豌豆進行染色體核型比較，以期更準確地研究不同品種(系)春箭筈豌豆間的相關性和在進化中的關系。

遺傳多樣性的來源主要包括形態學性狀、染色體、蛋白質、DNA等不同層次的變異，是生物多樣性的基礎和最重要的成分。已有關于箭筈豌豆形態學性狀[4]和RFLP分子標記遺傳多樣性[25]的相關研究，因此，今后可以對不同品種(系)春箭筈豌豆進行DNA分子水平變異的相關研究，如DNA序列分析、隨機擴增多態DNA分析(RAPD)、微衛星 DNA(Microsatellite DNA)分析、單鏈構象多態DNA分析(SSCP)、單核苷酸多態性(SNP)等；另外，隨著測序新技術的發展，可開發春箭筈豌豆進行特異分子標記，這可進一步加速春箭筈豌豆新品種的培育。

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