一株桑溝灣赤潮藻的分子鑒定

徐 娜,逄少軍,劉 峰

(1.中國科學院 海洋研究所,山東 青島 266071;2.中國科學院 研究生院,北京 100049)

桑溝灣位于山東半島最東端,是一個面向黃海的半封閉型海灣,水域廣闊,是北方重要的海珍品和大型藻類養殖基地。2011年5月開始,桑溝灣養殖區暴發較大規模赤潮,一直持續到 8月上旬臺風“梅花”來襲才完全消亡。赤潮高密度暴發區海水呈黃棕色,透明度明顯下降。赤潮使養殖區的鮑魚攝食大大減少。據當地養殖戶描述這種大規模赤潮在桑溝灣歷史上非常少見。桑溝灣養殖區環境質量優良,目前還沒有關于桑溝灣暴發赤潮的文獻記載。這次罕見的赤潮對桑溝灣環境及養殖業都造成了較大影響。作者采集了赤潮暴發區的海水,分離得到了一株優勢種赤潮藻并對其進行了鑒定。

赤潮藻類個體微小,傳統的鑒定主要通過在顯微鏡下觀察其形態學特征,這需要鑒定人員有豐富的經驗。此外一些有害赤潮藻種和無害物種形態相似,光學顯微鏡下難以分辨,需要電子顯微鏡下的細節觀察[1],而電鏡觀察需要設備條件及熟練的樣品處理能力。因此傳統的形態學鑒定方法受到一定的限制。基于DNA分子序列對物種的鑒定是一種簡單、準確而高效的分析方法,GenBank數據庫中也收錄了越來越多可供比對的分子序列,其中大部分信息較為可靠,因此非專業的藻類分類工作者易于通過分子序列完成對微藻的鑒定。18S rDNA和ITS序列是藻類分子鑒定和分類中最常用的分子指標[2]。本研究分離得到的赤潮藻在光學顯微鏡觀察下初步判斷為裸甲藻類似種,由于藻細胞固定時易變形,且電鏡觀察條件暫難滿足,因此作者以 18S rDNA和ITS分子序列為依據鑒定這株藻。

1 材料與方法

1.1 水樣的采集和種質的分離培養

2011年6月于桑溝灣養殖區赤潮發生水域(37.14N,122.55E)采集水樣 1L,裝入潔凈的聚乙烯塑料瓶置于低溫環境下帶回實驗室。水樣加入滅菌海水配制的f/2培養液[3-4](不添加硅酸鹽),在依據采集地環境設定的條件下進行富集培養。對觀察到的優勢藻在顯微鏡下進行藻種分離純化。定期觀察,得到純的藻種后擴大培養。培養溫度為 20℃,以白熾燈為光源,光照強度為 5 000 lx,光照周期控制在12L：12D。

1.2 分子鑒定

取50 mL處于對數生長期的純種藻液,7 000g離心5 min,棄上清收集藻細胞。用試劑盒提取基因組 DNA。18S rDNA序列的擴增采用真核生物 18S通用引物SSU-F/ SSU-R[5]。擴增ITS序列(包括ITS1、5.8S rDNA 和ITS2)的引物為 ITS1/ ITS2[2]。PCR反應體積50 μL,體系包括：模板基因組DNA 2.5 μL,引物(20 μmol/L)各 1.25μL,Taq酶預混合的 PCR反應液 25 μL,ddH2O 20 μL。18S 序列擴增循環程序為：94℃預變性10 min;之后94℃變性30 s,55℃退火45 s,72℃延伸90 s,循環32次;最后72℃延伸10 min[5]。ITS序列擴增程序為：95℃預變性5 min;之后94℃1 min,55℃ 1 min,72℃ 2 min,循環 30次,最后72℃延伸5 min[2]。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收目的片段,連接到 pMD19-T載體,并轉化感受態Escherichia coliDH-5α,用藍白斑法篩選陽性克隆。用菌液 PCR檢測白斑菌落,重組成功的菌落擴增培養后送至上海博尚測序公司測序。

將測得的序列在 NCBI用 BLAST (http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/)進行同源檢測,找出與其最相近的物種。在Genbank下載其他相關物種的18S rDNA序列及ITS序列,與該藻株的序列一起用BioEdit軟件的Clustal W[6]程序進行多序列對位分析。后用MEGA 4[7]的 Kimura 2-parameter 模型計算遺傳距離,采用鄰接法(neighbor-joining/NJ)[8]構建系統進化樹,用自展檢驗(bootstrap)[9]估計系統樹分支節點的置信度,自舉數據集為1000次。

2 結果與分析

2.1 形態學特點

分離純化得到的這株藻記錄為 SGW201106-1。生長狀態良好的藻液呈黃褐色。在顯微鏡下觀察,活躍的游動細胞長 10～15 μm,寬7～12 μm,游動較迅速。細胞橫溝明顯,將細胞分為基本同樣大小的上下兩部分(圖1)。鞭毛兩條,一條從細胞基部伸出,另一條從中間的橫溝處伸出。加入固定液后,細胞容易變形。根據形態特點初步判斷這株藻為裸甲藻類似種。

圖1 甲藻SGW201106-1的形態特征Fig.1 Light microscopic photos of strain SGW201106-1

2.2 基因序列分析

2.2.1 18S rDNA序列

經 PCR擴增后測序得到的藻株 SGW201106-1的 18S rDNA序列長度為 1 783 bp,將序列提交GenBank,得到序列索引號為JN986577。

將此18S rDNA序列經BLASTn搜索,與之比對得分最高的是卡羅藻K.micrum(=K.veneficum,見下文討論部分),并與 GenBank中收錄的 11條K.micrum18S rDNA序列的最大相似性都為99%。用MEGA 4以鄰接法(NJ)構建的18S rDNA系統進化樹見圖2,建樹所用的外類群為甲藻門塔瑪亞歷山大藻(Alexandrium tamarense)。圖2表明,SGW201106-1與11株K.micrum和1株K.veneficum聚為一支,再與同為凱倫藻科(Kareniaceae)的達卡藻屬(Takayama)聚在一起,與同科的凱倫藻屬(Karenia)親緣關系相對稍遠。

經Clustal W對位分析比較,SGW201106-1的18S rDNA與索引號為EF492506的K.micrum只在1 783 bp序列的第343個位點有一個堿基替換的差異。

2.2.2 ITS序列

PCR擴增后獲得SGW201106-1的ITS序列長度為687 bp,去除兩端多余rDNA序列后實際長595 bp,其中ITS1為218 bp,中間5.8S rDNA 159 bp,ITS2序列 218 bp,后提交至 GenBank獲得序列索引號JN986578。

ITS序列經BLASTn搜索,與之比對得分最高的前17條序列都是K.micrum和K.veneficum,與之相似性都高于97%,最高為100%。依據ITS序列構建的系統進化樹(圖3)中,SGW201106-1與GenBank中的11株K.micrum和6株K.veneficum完全聚在一起,支持率99%,后與Karlodinium屬另一種K.armiger聚為一支。這一支與同為 Kareniaceae科的Takayama屬聚在一起,最后再與同科的另一屬Karenia聚合。

經 Clustal W 對位分析比較,SGW201106-1的ITS序列與GenBank索引號為AJ557026的K.micrum只在595 bp的序列中第415、416位點有兩個堿基插入的差異,位于ITS2區。

圖2 依據18S rDNA序列通過鄰接法構建的系統樹(重復1000次計算bootstrap值),以Alexandrium tamarense為外類群Fig.2 The neighbor-joining tree of 18S rDNA sequences.Bootstrap values (%) of 1000 replicates are given adjacent to each node.Alexandrium tamarense is used as outgroup

以上結果表明,SGW201106-1的18S rDNA和ITS序列與GenBank中的K.veneficum/ K.micrum非常接近,而K.micrum與K.veneficum是同種異名,已被修訂為K.veneficum[10]。因此,本文中在桑溝灣赤潮水樣中的分離得到的這株優勢種甲藻為卡羅藻Karlodinium veneficum,屬于裸甲藻目(Gymnodiniales),凱倫藻科(Kareniaceae),卡羅藻屬(Karlodinium)。

3 討論

K.veneficum是一種常見的赤潮甲藻,它的分類名稱曾有多種,后經研究證實有幾種與它相近的甲藻都是同種異名。Daugbjerg等[11]將Gymnodinium galatheanum,Gymnodinium micrum,Gyrodinium galatheanum都修正為K.micrum,并認為與K.veneficum是同屬不同種。而Bergholtz等[10]則通過形態學比較和核糖體大亞基基因(LSU rDNA)分析,認為K.micrum與K.veneficum是同一種,將K.micrum修正為K.veneficum。Garcés等[12]的研究也表明K.micrum與K.veneficum的色素組成一致,支持Bergholtz的結論,認為二者應該為同一種。目前大多研究人員已接受K.micrum與K.veneficum為同一種的說法[13-18]。因此過去所有報道中用到的名稱(包括Gymnodinium galatheanum,Gymnodinium micrum,Gyrodinium galatheanum,Karlodinium micrum,Karlodinium galatheanum,Gymnodinium veneficum)都應當修正為K.veneficum。K.veneficum之前廣被接受的中文譯名是微小卡羅藻,由K.micrum翻譯而來,修正為K.veneficum后,國內有一篇中文文章將其譯為劇毒卡爾藻[19]。

K.veneficum屬于裸甲藻目(Gymnodiniales),是一種世界廣布性的赤潮甲藻且能產生卡羅藻毒素[20-21],曾被報道在歐洲、非洲和北美洲等很多地方引起赤潮并導致魚類死亡[22]。在中國,關于K.ve-neficum引發赤潮的正式報道較少,其曾在中國香港海域發生過赤潮,但沒有相關魚類死亡的報道[23-24]。另有文章提到2005年6月K.veneficum與其他藻一起在洞頭東海海域引發赤潮,但其不是主要優勢種;2007年6月,K.veneficum在象山灣的一個蝦池中大量暴發[25]。

圖3 依據ITS序列通過鄰接法構建的系統樹(重復1000次計算bootstrap值),以Alexandrium tamarense為外類群Fig.3 The neighbor-joining tree of ITS sequences.Bootstrap values (%) of 1000 replicates are given adjacent to each node.Alexandrium tamarense is used as outgroup

桑溝灣是中國北方地區歷史悠久的水產養殖灣之一,其養殖區環境優良[26],大型海藻海帶養殖規模很大,其中也夾雜著部分牡蠣、扇貝以及鮑魚的筏式混養。桑溝灣被認為是海水水產動物和植物養殖搭配合理的典范。因此其水質中營養鹽基本保持平衡,多年來鮮有大面積赤潮發生。2011年5月份的這次赤潮規模在桑溝灣歷史上比較罕見。另外,先前科研人員對桑溝灣浮游植物優勢種調查結果中都沒有發現卡羅藻K.veneficum[27-29]。因此不排除K.veneficum來自桑溝灣以外水域環境的可能。鮑魚和龍須菜在我國福建養殖區和桑溝灣的季節性互移養殖[30-31]都有可能將新的物種從南方水域帶入桑溝灣。K.veneficum在桑溝灣被發現是否屬于這種情況需要進一步的數據支持。桑溝灣有豐富的營養物質基礎及適宜的環境條件,外來種一旦遇到這些適宜的條件,容易暴發性增長。桑溝灣海區溶解無機氮和活性磷酸鹽的濃度在夏秋季高于春冬季,夏秋季陸源豐水期河流徑流水攜帶大量的工農業廢水和城市生活污水中所含氮、磷化合物進入該灣[32],而 5、6月份灣內養殖的大量海帶、裙帶菜等大型藻類多已采收完畢,對海水中營養鹽的消耗減少,因此此時的高營養水平是赤潮暴發的物質基礎。另外此時恰逢高水溫期,風力小,為赤潮暴發和蔓延提供了最適宜的條件。赤潮暴發后,對當地的養殖業帶來較大影響,本項研究的結果將為今后桑溝灣海區環境監測和赤潮預防提供有價值的信息。

致謝：感謝山東榮成市蜊江水產有限責任公司的工作人員在水樣采集中給予的幫助。

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