波紋唇魚mtDNA D-loop序列變異分析

胡 靜,齊興柱,尹紹武,,駱 劍,朱曉平,祝 斐,胡亞麗

(1.海南大學 海洋學院,海南大學熱帶生物資源教育部重點實驗室,海南 海口 570228;2.南京師范大學生命科學學院,江蘇 南京 210046)

波紋唇魚(Cheilinus undulatus),俗稱蘇眉,曲紋唇魚,隸屬鱸形目(Perciformes)、隆頭魚科(Labridae)、唇魚屬(Cheilinus),分布于大洋洲、太平洋西部熱帶海域、大堡礁、印度洋西北部及紅海[1]。在中國分布于南海與東海的南部海域[2],海南的萬寧、陵水、三亞等海域以及臺灣、香港。波紋唇魚肉質細嫩而爽滑,味甚鮮美,營養價值高,深受亞洲人喜愛,需求的劇增和巨額的利潤吸引人們大量捕殺波紋唇魚,加之環境污染、珊瑚礁棲息地的破壞等因素,自然海區的波紋唇魚數量越來越少,目前已經瀕臨絕種。因此,有關波紋唇魚的的遺傳資源調查、資源保護、人工繁殖等工作亟待加強。

對于波紋唇魚,國內的研究及公開報道很少,僅在食用中毒及中毒后急救護理和形態學兩方面有少許報道[3]。目前已有一些繁殖和生理特性方面的研究[4-5],國外對波紋唇魚的生物學等方面報道較多[6-7],但仍未見關于波紋唇魚線粒體控制區的研究報道。近年來,隨著mtDNA的研究不斷深入,同時因為其具有分子小、結構簡單、演化速度快、母系遺傳等優點而作為有效的分子標記廣泛應用于物種系統進化研究[8],而mtDNA的控制區或D-loop區是最有意義的區域,也是線粒體基因組進化最快的部分[9]。本研究對海南近海海域波紋唇魚種群 mtDNA D-loop區進行擴增、克隆及測序,旨在研究波紋唇魚控制區的序列變異情況,分析其序列多態性,以獲得相關數據,為該種群遺傳多樣性和保護生物學的研究提供科學資料。

1 材料與方法

1.1 材料

25尾波紋唇魚樣品于2009年采自海南三亞海域,平均質量約350 g,長約30cm,均為1齡魚。取其肌肉于超低溫冰箱中儲存(-80℃)備用。

1.2 方法

1.2.1 總DNA提取

分別取25尾個體(編號為1～25)0.1 g肌肉組織以提取總DNA。總DNA的提取按常規的“酚-氯仿”方法進行[10],DNA經異丙醇沉淀、70%(體積分數)乙醇洗滌并干燥后,用50μLTE溶解,-20℃保存備用。

1.2.2 PCR擴增

采用PCR擴增mtDNA D-loop區靠近Cyt b基因的蘇氨酸 tRNA基因和脯氨酸 tRNA基因及其后的D-loop序列。采用PCR類別為巢式PCR,通過引物設計所得巢式PCR正鏈引物和反鏈引物見表1。

表1 引物序列Tab.1 The sequences of primer

巢式PCR分步進行兩次,每個 PCR的總體積為25 μL,其中模板 1 μL,PCRmix12.5 μL(天根生化科技有限公司);去離子雙蒸水 8.9 μL;正、反鏈引物各1.3 μL,兩步引物分別為 cheilD-loopsen1、cheilD-loopant1和 cheilD-loopsen2、cheilD-loopant2。第一步PCR程序：94℃預變性4 min,然后進行30個熱循環(94℃、30 s,54℃、30 s,72℃、2 min),72℃延伸 10 min;10℃保溫。第二步PCR的模板為第一次反應產物,其退火溫度為51℃,其他程序與以上相同。

1.2.3 PCR產物克隆

擴增產物用DNA純化試劑盒純化。將目的片段與pMDTM18-T Vector*1(寶生物工程有限公司)連接。連接產物與 DH5ɑ感受態細胞[11]充分混勻轉化。挑取目的單克隆菌落于含有氨芐的液體培養基中擴大培養,后菌液PCR。測序工作由天根生化科技(北京)有限公司操作。

1.2.4 數據分析

測序結果在 BLAST上進行比對分析;在ClustalX軟件上對比以剪切所有序列為相近長度;整理后的序列在MEGA軟件上計算個體間的遺傳距離,并構建UPGMA和NJ系統樹;DNASP軟件上計算遺傳多樣性參數,及堿基含量、突變位點等。

2 結果

2.1 目的片段的序列特征及群體內的序列變異

本實驗共測定了波紋唇魚 25尾個體的 mtDNA D-loop序列片段,在對比除去部分端部序列后,堿基序列長度共出現 4種情況：1141bp、1142bp、1143bp、1144bp,即 25個序列中存在堿基缺失或插入的情況。利用 BLAST軟件將 25個序列與 NCBI上波紋唇魚線粒體全序列(序列號：GU296101)的D-loop序列區域進行對比,結果表明兩者同源性很高,均為97%～99%。A、T、C、G 4個堿基在25尾個體中的平均含量分別為 27.6%、24.9%、28.4%、19.1%(表2),且 AT 含量(52.5%)高于 CG 含量(47.5%)。

表2 25尾波紋唇魚線粒體D-loop序列堿基含量(%)Tab.2 Nucleotide compositions of mtDNA D-loop sequences in 25 C.undulatus(%)

波紋唇魚D-loop序列變異位點如表3所示。25尾個體中共檢出66個變異位點,其中包括0個堿基缺失,4個堿基插入,59個轉換位點,2個顛換位點及1個轉換和顛換同時存在的位點。結果可以看出,在所有核苷酸序列中變異位點主要分布在 200bp～1 000bp。

2.2 群體內遺傳多樣性

2.2.1 遺傳多樣性參數

由DNASP軟件計算出這25尾個體的遺傳多樣

性參數[12],單倍型數目h為25,單倍型多樣性Hd為1,多態位點數(S)為62,核苷酸多樣性(Pi)為0.00606,平均核苷酸差異數(K)為6.907。

表3 變異位點在25尾波紋唇魚D-loop序列中的分布Tab.3 Distribution of D-loop variable sites in 25 C.undulatus

2.2.2 個體間的遺傳關系

應用MEGA5.0軟件,根據D-loop序列計算出了25尾個體間的 Kumar遺傳距離(表4)。從表4可以看出,25尾個體任何兩個個體間的遺傳距離不為零,即任何 2個個體的核苷酸序列不完全相同,故共有25個單倍型;個體10和個體11之間的遺傳距離最大(0.015),個體13及個體個體22分別與個體17之間的遺傳距離最小(0.001)。由此可以看出個體間的差異很小。

以25尾個體的D-loop序列構建的NJ系統樹分別如圖1所示。從圖中可見,25尾個體形成了2大分支。線粒體DNA屬于母系遺傳,可推斷該群體的25個個體可能來源于2個不同母系祖先[13]。

3 討論

3.1 目的片段序列特征及變異分析

A、T、C、G 4個堿基在25尾個體中的平均含量為27.6%、24.9%、28.4%、19.1%(表2),且AT含量(52.5%)高于CG含量(47.5%)。結果表明波紋唇魚mtDNA D-loop基因的 AT含量與稀有白甲魚(Onychostoma rara)D-loop基因的AT含量(66.1%)非常接近[14],這也符合脊椎動物mtDNA D-loop區域堿基組成的特點[15]。

3.2 遺傳多樣性以及個體間的遺傳關系分析

由DNASP軟件計算出這25尾個體的遺傳多樣性參數,單倍型數目h為25,單倍型多樣性Hd為1,多態位點數(S)為 62,核苷酸多樣性(Pi)為 0.00606,平均核苷酸差異數(K)為 6.907,從表4可以看出 25尾波紋唇魚個體間的遺傳距離很小,即個體間的差異很小。

魚類線粒體DNA D環是mtDNA中不編碼多肽鏈的核苷酸片段,無修復系統,不受選擇壓力的影響,因而積累了較多的變異[16]。mtDNA母系遺傳特性使得相對較少個體即可代表該群體的有效樣本,因此,這些參數已經能代表該群體的 D環序列的變異水平。

波紋唇魚個體間的差異很小其原因可能是波紋唇魚群體由一個較小的有效群體迅速增長形成,雖然通過變異產生了單倍型多態性,但還未能積累相對較豐富的核苷酸序列的多樣性[17]。

由實驗結果得出,波紋唇魚單倍型多樣性程度較高而個體差異較低。由于有限的群體會導致近交頻繁發生進而加劇遺傳多樣性的減少[18],而過度捕撈也會降低個體核苷酸序列一致的幾率,故波紋唇魚的以上遺傳變異情況可能受其分布地域小和過度捕撈影響嚴重。目前波紋唇魚的野生資源有限,波紋唇魚分布較窄,有利于個體間產生基因交流,而基因交流會進一步地減少個體間的差異,使得遺傳多樣性降低。此外,由于需求增加和利潤吸引,波紋唇魚的漁業捕撈強度日益加大,群體數量劇烈減少,小群體產生的基因丟失某種程度上會降低該群體的遺傳多樣性,故捕撈過度必然導致遺傳多樣性的降低。

圖1 由D-loop 序列得到的NJ系統樹(無其他序列作參照)Fig.1 NJ phylogenetic tree based on D-loop sequences Bootstrap (500 replicateseed=64238)

Pi值是衡量群體多態程度和群體遺傳分化的重要指標之一,Pi值越大表示群體多態程度越高,反之亦然。本研究所得的波紋唇魚遺傳多樣性參數Pi較黑鯛的 D-loop數值(Pi=0.00903)[19]和稀有白甲魚的D-loop數值(Pi=0.0107)[14]低。這種現象可能與種類差異和棲息地及活動范圍狹窄有關,因為波紋唇魚為珊瑚礁棲息類魚,而珊瑚礁正大面積的污染,甚至面臨瀕臨消失的險境。此外,作為近幾年的增養殖魚類,波紋唇魚的遺傳多樣性在一定程度上也受到了由于人工苗種培育而導致的近郊等方面的影響。

本研究基于線粒體D-loop序列變異對海南近海海域的波紋唇魚進行了遺傳多樣性研究,有關結果尚不能肯定人為因素對其遺傳多樣性影響的程度,但仍不能忽視對波紋唇魚的必要保護和管理;也不能完全反映所有波紋唇魚群體遺傳多樣性水平和群體分化程度,但為后續的波紋唇魚研究積累了遺傳多樣性參考資料。

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