刺參腸道與養殖池塘環境中異養細菌和弧菌數量周年變化

李 彬,榮小軍,廖梅杰,張 正,王印庚,王 嵐,劉智超,3,薛太山

(1.中國水產科學研究院 黃海水產研究所,青島市海水魚類種子工程與生物技術重點實驗室,山東青島266071;2 .青島瑞滋海珍品發展有限公司,山東青島266409;3.中國海洋大學,山東青島 266100)

近年來,刺參養殖業發展迅速,成為中國北方主要的養殖品種之一,隨著刺參養殖規模的不斷增加,各種病害接踵而至,嚴重制約了該產業的健康和持續發展[1],其中“腐皮綜合征”最為嚴重,死亡率可達90%以上[2],該病的發生具有季節性,一般在冬、春低溫季節爆發[3],低溫季節刺參處于冬眠時期,很難用藥物投喂的方式進行疾病的預防和治療,從生態學角度入手,掌握該病發病原因是進行預防的關鍵。

刺參屬底棲食性生物,主要以棲息環境中微生物、原生動物、微藻、大型藻類碎片、有機碎片、海泥等為食[4],攝入的食物復雜,其中也包括一些病原微生物。養殖環境中菌群變化直接影響著刺參腸道內細菌群落組成,與疾病的發生密切相關。因此,研究刺參腸道與養殖池塘環境中細菌數量的周年變化,掌握細菌數量的變化規律對疾病的預防尤為重要。迄今尚未見刺參腸道與養殖池塘環境中細菌數量周年變化的報道。本文通過對刺參腸道和養殖環境異養細菌和弧菌數量的周年變化及刺參疾病多發季節優勢菌的鑒定,為刺參腸道與養殖環境細菌的相關性分析和病害防控提供有益參考。

1 材料和方法

1.1 采樣時間及地點

2008年9月～2009年9月,每個月定期對青島膠南市室外刺參腸道與養殖池塘環境中細菌數量進行調查,采樣坐標北緯 35°39′,東經 119°50′,采樣選 3個池塘,池塘長400 m、寬100 m、水深1.8 m,每個池塘設立3個采樣點。

1.2 樣品采集

利用調查船駛到池塘中預先標記好的采樣點,按照《國家海洋調查規范》海洋生物調查中規定的方法進行采樣,使用擊開式采水器(2.5 L)采集水體表層(距水面約5cm)、水體底層(距底表5cm)水樣;用采泥器采集池塘表層底泥,每個池塘取 9片瓦狀附著基(每個采樣點3片),用無菌勺刮取刺參附著基上的沉積物,放入無菌袋中,每個池塘采集9頭刺參(每個采樣點 3頭),無菌操作下取完整腸道用鑷子輕輕擠出內容物,樣品采集后4℃保存,在12 h內處理。

1.3 細菌計數方法

1.3.1 可培養異養細菌總數(HPC)

對樣品進行梯度稀釋,取 0.1 mL直接涂布于TSB海水培養基上,28℃培養2 d計數,選取平均菌落數在 30～300之間的平板計數,計數菌落形成單位數(Colony Forming Units ,CFU)。

TSB培養基：胰蛋白胨大豆肉湯(TSB) 30 g,NaCl 15 g,瓊脂 15 g,海水 1 000 mL,pH 7.4～7.6,121℃,20 min滅菌。

1.3.2 弧菌總數(VBC)

對樣品進行梯度稀釋,取 0.1 mL直接涂布于TCBS弧菌培養基上,28℃培養2 d計數,計數方法與異養細菌總數計數方法相同。

1.4 細菌鑒定

1.4.1 細菌基因組DNA提取方法

將細菌接種在 TSB平板培養基上,28℃培養過夜。取單菌落懸浮于50 μL 無菌生理鹽水(1.5%)中,100 °C水浴5 min,12 000 r/min離心5 min,取上清備用。

1.4.2 16S rDNA序列的克隆與測序

用細菌通用引物 27F(5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’)和 1492R(5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’)對純培養細菌16S rDNA序列進行PCR擴增,并對擴增產物進行克隆測序。

1.4.3 序列的分析和系統發育樹的構建

16S rDNA序列在NCBI中用BLAST進行同源性比較,從中選取與其相似性最高的細菌16S rDNA序列,采用Clustalw軟件進行多序列匹配排序,用系統發生推斷軟件包PHYLP 3.67進行聚類分析。采用鄰位相連法獲得系統發育樹,通過自舉進行系統進化樹的評估,自舉的數據集為1 000次。

2 結果

2.1 刺參腸道與養殖池塘環境中細菌數量周年變化

刺參腸道與養殖池塘環境中異養細菌數量同期差異較大如圖1,水體表層異養細菌為 90～4.1×104CFU/mL,水體底層異養細菌為 1.04×102～1.37×105CFU/mL,底泥異養細菌為 9.80×104～6.72×106CFU/g,附著基異養細菌為 2.78×105～2.57×107CFU/g,腸道中異養細菌為 1.85×105～2.17×109CFU/g,同期水體中水底異養細菌數量高于水表,但差異不大。水體與底泥、附著基、腸道中異養細菌數量差異顯著,最高可達3個數量級,其中,腸道內異養細菌數量最高,其次是附著基、底泥。從時間分布上,刺參腸道與養殖環境中異養細菌數量的變化趨勢基本相同,秋季、夏季異養細菌數量較高,冬、春季較低。在 10月份、7月份分別達到高峰,水體中6月份、7月份細菌數量有下降趨勢。隨著季節的變化,底泥中異養細菌數量變化幅度較小,水體、附著基、刺參腸道中異養細菌的數量變化幅度較大。

圖1 刺參腸道與養殖池塘環境中異養細菌數量周年變化Fig.1 Annual changes of heterotrophic bacteria in the intestine and cultured environment of A.japonicus

2.2 刺參腸道與養殖池塘環境中弧菌數量周年變化

刺參腸道與養殖池塘環境中弧菌數量同期差異較大如圖2,養殖水體表層弧菌數量為 11～2.4×103CFU/mL,水體底層弧菌數量為19～5.3×103CFU/mL,底泥中弧菌數量為 1.01×104～5.75×105CFU/g,附著基弧菌數量為 4.6×104～1.31×107CFU/g,刺參腸道中弧菌數量為 4.1×104～2.2×108CFU/g。刺參腸道與養殖池塘環境中弧菌數量同期比較與異養細菌一致：腸道＞附著基＞底泥＞水底＞水表。從時間分布上看,弧菌數量的周年變化趨勢和異養細菌的變化趨勢相似。在1～4月份,水體和刺參腸道中弧菌數量開始急劇上升,刺參腸道和附著基弧菌數量在 7月份達到最高值,水體和底泥中弧菌數量在10月份達到最高值。底泥中弧菌數量季節變化幅度較小,水體、附著基、刺參腸道中弧菌數量變化幅度較大。

圖2 刺參腸道與養殖池塘環境中弧菌數量周年變化Fig.2 Annual changes of vibrio bacteria in the intestine of A.japonicus and cultured environment

2.3 刺參腸道與養殖環境中弧菌占異養了細菌比例的周年變化

由刺參腸道與養殖環境(水體、底泥、附著基)中弧菌與異養細菌數量的比值可以看出,底泥、附著基、腸道中弧菌與異養細菌數量的比例平均水平高于水體。冬季和春季細菌總數較低,而弧菌與異養細菌的比值一直處于較高的水平,其中底泥1月份和4月份最高可達43.8%、43.2%,9月份、10月份雖然細菌總數較高,而弧菌與異養細菌的比值處于較低的水平,如圖3。

圖3 養殖腸道與環境中弧菌與異養細菌數量的比值Fig.3 The ratio of vibrio to heterotrophic bacteria in the cultured environment and intestinal tract

2.4 冬、春季節優勢細菌 16S rDNA分子鑒定

利用平板培養的方法從弧菌比值較高的冬、春季節分離了 8株優勢菌,并進行16S rDNA測序,8株菌所測得的序列結果通過互聯網 NCBI,在Genbank采用BLAST程序與其他細菌的16S rDNA序列進行比對,找出相似性高的序列構建系統進化樹(圖4),優勢菌鑒定為：施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)、門多薩假單胞菌(P.mendocina)、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)、燦爛弧菌(Vibrio splendidus)、Shewanella affinis、殺鮭弧菌(V.salmonicida)、S.kaireitica,同源性在 99%以上。所測得的8株優勢菌其中有7株菌屬于變形菌門的γ-變形菌綱,1株為芽孢桿菌。冬、春兩季優勢菌均發現有燦爛弧菌。

圖4 優勢菌16S rDNA基因序列聚類分析結果Fig.4 Results of 16S rDNA cluster analysis

3 討論

3.1 刺參腸道與養殖環境(水體、底泥、附著基)中細菌數量周年變化

刺參養殖塘營養結構簡單、食物鏈短,養殖過程中投餌、養殖動物排泄物和有機生物殘體等物質的分解容易造成水體污染[5],為了保持刺參養殖塘中良好的水質條件,養殖期間定時的大量換水,水體透明度比較高,水體表層有機物質含量較少,細菌總數也相對較少,底層水體中細菌總量還受底泥表層細菌的影響,水體底層細菌數量顯著高于表層,與張振飛等[6]鋸緣青蟹養殖環境中細菌數量和類群變化的結果一致,底層與表層水溫的差異也是底層細菌數量高于表層的原因之一。

附著基是細菌繁殖的有利場所,在附著基上有大量的底棲生物附著,生物量非常豐富,因此,本研究結果表明,附著基細菌量比較豐富,細菌數量在105～108CFU/g,李筠等[7]對海灣扇貝附著基異養細菌的數量進行了研究,其海灣扇貝附著基異養細菌數量與本研究有一定的差異,可能是海灣扇貝幼蟲在附著基上的代謝產物或者分泌的特殊物質有利于細菌的大量生長和繁殖。刺參養殖池塘底泥中含有大量的刺參排泄物、殘餌以及一些大型藻類的殘體,這種環境非常適宜細菌的生長繁殖,因此在底泥中滋生大量細菌。刺參攝食無選擇性[8],在池塘底層攝入大量的底泥、有機物質以及大量的細菌,加之刺參的腸道中有穩定的細菌菌群輔助消化[9],腸道中細菌數量較多。

影響刺參腸道與養殖環境中菌群變化的因素有水溫、無機營養鹽、水體中浮游生物及其刺參的攝食活動情況。細菌數量的變化趨勢和水溫的變化一致,溫度對大多數異養細菌的新陳代謝能力產生一定影響,是造成細菌季節變化的主要因素[10],水溫還能影響刺參攝食和生理活動,間接影響刺參腸道與養殖環境中菌群的變化。秋季9月份水溫20℃左右,刺參結束夏蟄開始活動攝食,10月份水溫18 ℃左右,刺參攝食、活動活躍,池塘沉積物中有大量的刺參排泄物,為細菌的增長提供了營養物質,此時期還是投餌的主要時段,未被攝食的殘餌也促進了細菌的增殖,細菌數量較多。11月份水溫較低,刺參開始冬眠,細菌代謝活動、繁殖能力較弱,細菌數量開始下降,冬季 12月份水溫在 6℃左右,刺參處于冬眠時期,低溫條件抑制了細菌的生長和有機物質的分解,細菌的含量顯著低于11月,1月份水溫2 ℃,細菌數量達到最低。3月份或4月份隨著溫度的回升,細菌數量增加較顯著,6月份、7月份水體表層中細菌數量有所下降,可能是受水溫或者水體有機物的影響。

3.2 刺參疾病多發季節(冬、春季)優勢菌分析

冬、春季弧菌數量與異養細菌數量比例較高,特別是在3、4月份比例顯著增高,說明刺參池塘部分弧菌具有耐受低溫能力,通過優勢菌的鑒定,冬、春季節均發現有燦爛弧菌,燦爛弧菌是引起養殖刺參“腐皮綜合征”的主要病原菌,該株細菌能夠在溫度較低的環境中生長,與王印庚等[3]養殖刺參腐皮綜合征病原菌的分離與鑒定的研究結果一致。冬、春季節養殖環境與腸道中優勢菌還存在假單胞菌、芽孢桿菌,其分析結果與近年來國內外有關海洋微生物多樣性的報道一致[11-12]。正常情況下,刺參腸道中的燦爛弧菌與芽孢桿菌等處于一種平衡狀態,在低溫狀態下,刺參抵抗力較弱,環境變化容易使細菌菌群平衡遭到破壞,部分低溫致病菌繁殖迅速,從而引發疾病[13]。

生態養殖是漁業可持續發展的重要保證[14],利用益生菌來改善養殖環境、調節養殖動物腸道中菌群組成[15-16],從生態學角度入手,預防疾病的發生,為水產養殖業朝著綠色健康養殖的方向發展提供新的途徑[17]。冬、春低溫季節是刺參疾病的多發季節,多數水產微生態是從陸生動物養殖環境和腸道中分離獲得[18],不耐受低溫,不適于刺參養殖環境,因此,從刺參疾病多發的低溫季節篩選土著益生菌,更有利于疾病的防控。本研究在冬、春季節發現有蠟狀芽孢桿菌,有報道蠟狀芽孢桿菌可以維持動物腸道中微生態平衡和恢復腸道正常菌群的作用[19-20],該菌能夠耐受低溫,并且是刺參腸道和養殖環境中的土著菌,能夠更好地適應低溫刺參養殖環境,可以作為潛在的益生菌應用于低溫疾病多發季節的疾病預防。

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