鹽酸頭孢吡肟（含精氨酸）內毒素動態濁度法方法的確立

周曉華 許 苑

1.蘇州大冢制藥有限公司，江蘇蘇州215025；2.衛材中國藥業有限公司，江蘇蘇州215021

細菌內毒素檢查法主要有凝膠法和光度法，前者進行限度檢查和半定量檢測，后者則可以進行定量檢測。光度法包括濁度法和顯色基質法。濁度法系利用檢測鱟試劑與內毒素反應過程中的濁度變化而測定內毒素含量的方法。濁度法分為動態濁度法和終點濁度法。動態濁度法是檢測反應混合物的濁度到達某一預先設定的吸光度所需要的反應時間，或是檢測濁度增加速度的方法。目前國內內毒素檢測，采用凝膠法的較為普遍，而用光度法建立測試方法的不是太多。本研究旨在通過方法學驗證，確定鹽酸頭孢吡肟（含精氨酸）內毒素動態濁度法的檢測方法[1]。

1 材料與方法

1.1 檢測儀器

日本和光內毒素試驗儀、型號ET-5000。

1.2 檢測試劑和標準品

鱟試劑——湛江安度斯（批號：0909182，靈敏度10～0.01 EU/mL）。內毒素試驗用水：滅菌注射用水（山東齊都藥業有限公司，批號ID09122807）；內毒素標準品：中檢院150601-200966[2]；試驗樣品：鹽酸頭孢吡肟（含精氨酸）（意大利DOBFAR，批號：（1）440253 00019；（2）440253 00029；（3）440253 00039）。

1.3 方法

1.3.1 內毒素標準溶液制備 用內毒素標準品制成0.015 63、 0.031 25、0.625 00、0.125 00、0.250 00 EU/mL的標準溶液。

1.3.2 供試溶液制備 將頭孢吡肟制成濃度為0.65 mg/mL的溶液進行測定。

1.3.3 濁度法的試驗方法 濁度法系利用檢測鱟試劑與內毒素反應過程中的濁度變化而測定內毒素含量的方法。本次驗證的動態濁度法是檢測反應混合物的濁度到達某一預先設定的吸光度所需要的反應時間的方法。測定試驗在內毒素試驗儀和光ET-5000中進行，溫度為（37±1）℃，測定時間為90 min（反應時間也可以設置為60 min）[3]。

1.3.4 標準曲線的建立方法 （1）當使用新批號的鱟試劑或試驗條件發生了任何可能會影響檢驗結果的改變時需進行標準曲線的可靠性試驗。（2）用標準內毒素配成溶液，并制成至少3個濃度的稀釋液（相鄰濃度間稀釋倍數不得＞10），最低濃度不得低于所用鱟試劑的標示檢測限。每一濃度至少做3支平行管。同時做3支陰性對照。當陰性對照的反應時間大于標準曲線最低濃度的反應時間，將全部數據進行線性回歸分析。（3）標準曲線的計算方法：將濃度與反應時間分別取對數后，將兩組數據用最小二乘法統計就能夠擬合出直線——標準曲線。見圖1。

圖1 標準曲線的計算方法

1.3.5 干擾試驗 供試品的最小有效稀釋濃度c=λ/L，其中λ=0.015 6 EU/mL，L=0.024 EU/mg，供試品最小有效稀釋濃度為0.65 mg/mL。稱取頭孢吡肟樣品，稀釋成0.65 mg/mL，作為供試品溶液。

選擇標準曲線中點或一個靠近中點的內毒素濃度（設為λm），作為供試品干擾試驗中添加的內毒素濃度。制備溶液A、B、C和D。其中A為稀釋倍數不超過MVD的供試品溶液。B為加入了標準曲線中點或靠近中點的一個已知內毒素濃度的，且與溶液A有相同稀釋倍數的供試品溶液。C為如“標準曲線的可靠性試驗”項下描述的，用于制備標準曲線的標準內毒素溶液。D為陰性對照[4]。見表1。

按所得線性回歸方程分別計算出供試品溶液和含標準內毒素的供試品溶液的內毒素含量Ct和Cs，再按下式計算該試驗條件下的回收率（R）。

當內毒素的回收率在50%～200%之間，則認為在此試驗條件下供試品溶液不存在干擾作用。當內毒素的回收率不在指定的范圍內，可通過對供試品進行更大倍數的稀釋或通過其他適宜的方法（如過濾、中和、透析或加熱處理等）排除干擾。見表2。當鱟試劑、供試品的來源、配方、生產工藝改變或試驗環境中發生了任何有可能影響試驗結果的變化時，須重新進行干擾試驗。1.3.6 判定標準 標準曲線的相關系數（r）的絕對值應≥0.980；用溶液B中的內毒素濃度減去溶液A中的內毒素濃度后，計算出的內毒素的回收率要在50%～200%的范圍內；陰性對照的反應時間大于標準曲線最低濃度的反應時間。

表1 標準曲線各濃度的制備方法和制備個數

表2 標準曲線的可靠性試驗記錄

表3 干擾試驗記錄

2 結果

2.1 標準曲線的可靠性試驗記錄

5個濃度的標準溶液與反應時間分別取對數后制成的標準曲線，其相關系數在0.980以上，符合要求。見表2。

2.2 干擾試驗記錄

3個批次的頭孢吡肟樣品，其回收率都在50%～200%之間，符合要求。見表3。

3 討論

從鹽酸頭孢吡肟（含精氨酸）在濃度為0.65 mg/mL時進行內毒素動態濁度法測試的數據來看，回收率都在50%～200%范圍內，標準曲線的相關系數在0.980以上，且陰性對照的反應時間大于標準曲線最低濃度的反應時間。證明該方法具有較高的靈敏度和準確度，可以準確定量。

[1] 中華人民共和國藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）[M].北京：中國醫藥科技出版社，2010：附錄99-102.

[2] 國家食品藥品監督管理局藥品認證管理中心.藥品GMP指南[M].北京：中國醫藥科技出版社，2011：209-258.

[3] 日本藥局方編輯委員會.第十六改正日本藥局方解說書[M].東京：廣川書店，2011：附錄B429-448.

[4] 美國藥典委員會.美國藥典[M].USP34-NF29，美國藥典委員會，2011：78-81.