聚乙二醇脅迫雜交桑品種桂優62叢生芽部分生化指標的變化

余亞圣 黎其友 趙愛春 金筱耘 李曄 余茂德

（西南大學生物技術學院，重慶 400716）

桑樹是多年生木本植物，抗逆性能較強，即使在極度干旱的沙漠邊緣和冰凌冷寒的北疆地帶都可以見到桑樹[1]。因此，隨著蠶桑產業的發展，科學研究的推進，桑樹不再只是養蠶的飼料來源，桑樹多元化特別是作為生態樹種具有廣闊的前景，也是科技工作者關注的焦點[2]。但是桑樹種質資源豐富，品種之間的抗逆性能有顯著差異。研究表明，木本植物在受到水分脅迫時，可溶性糖和脯氨酸含量有所增加，活性氧自由基積累導致膜脂過氧化，植物細胞的結構受到影響，細胞質膜相對透性增加，體內氧化物質增加，從而會導致細胞膜發生過氧化。許多樹種相關研究顯示，質膜透性與細胞膜過氧化產物丙二醛（MDA）含量的高低與細胞膜的傷害程度一定程度上呈正相關關系[3]，因此，可溶性糖、脯氨酸和丙二醛常常作為鑒定木本植物抗旱性的部分生化指標。聚乙二醇（polyethvlene glycol，PEG）是一種高分子滲透調節劑，能夠奪取水分對植物造成滲透脅迫，利用它的滲透調節能力處理外植體，提高種子活力及抗逆性是近年來水分脅迫研究的內容之一[4－6]。本實驗室桑樹胚軸、子葉離體再生體系已經建立，桂優62桑樹是商品化的優良雜交品種，發芽早，產葉量高，因此本實驗在培養基中添加PEG模擬水分脅迫，測定組培苗的可溶性糖、脯氨酸和丙二醛含量的變化，桑樹雜交品種的抗水分脅迫能力提供參考，也為篩選桑品種水分脅迫提供一條新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

桂優62號桑種（購自廣西蠶業技術推廣總站）。配制5個濃度分別為1%、3%、5%、7%、10%PEG溶液。

1.2 試驗設計

種子用雙蒸水預培養24h，然后用0.1%的升汞消毒2～3min，接著用75%的酒精消毒20 s，最后用雙蒸水沖洗3～5次，在超凈工作臺上將上述種子分裝到已滅菌的PEG溶液中，并以雙蒸水作為對照，每瓶100粒種子，最后將4個培養瓶放入搖床進行培養（28℃，100r/min）。將1%、3%、5%、7%、10%的PEG溶液滅菌以后在超凈工作臺中加入MS誘導培養基中，待桑種長出胚軸后，剝出子葉、胚軸接種。培養條件參照王茜齡等[7]，誘導出的叢生芽備用。

1.3 可溶性糖含量的測定

采用苯酚法[8]測定可溶性糖含量，標準曲線方法略。取叢生芽0.3g，加5mL蒸餾水研磨成勻漿，倒入試管中，用塑料膜封口，于沸水中浸提30min（提取兩次）提取液過濾入25mL容量瓶中，反復沖洗試管及殘渣，定容至刻度。吸取0.5mL樣品液于試管中（重復2次），加蒸餾水1.5mL，向試管內加入1mL9%苯酚溶液，搖勻，再從管液正面以5～20s加入5mL濃硫酸，搖勻。比色液總體積為8mL，在室溫下放置30min，然后以空白為參比，在485nm波長下比色測定吸光度，由標準曲線得出糖的含量。

于485nm波長處測定吸光度。以下公式計算可溶性糖含量：

其中：C—標準曲線得出糖的含量（μg）；VT—提取液體積（mL）；VS—測定時取用樣品體積（mL）；N—稀釋倍數；W—樣品質量（g）。

1.4 脯氨酸含量的測定

采用磺基水楊酸浸提植物脯氨酸，酸性茚三酮顯色處理，于室溫下用二甲苯萃取顯色物質，取上清，520nm波長下比色，利用以下公式計算脯氨酸含量：

其中：C—標準曲線得出脯氨酸含量（μg）；V—提取液總體積（mL）；a—測定時所吸取的體積（mL）；W—樣品質量（g）。

1.5 丙二醛（MDA）含量的測定

參照文獻[9]的巴比妥酸顯色法，用三氯乙酸提取MDA，2－硫代巴比妥酸顯色，分別于532nm，600nm，450nm處測定吸光度。利用公式C（μmol/L）＝6.45（A532－A600）－0.56A450消除由蔗糖引起的誤差。其中：A450、A532和A600分別表示450nm、532nm和600nm處的吸光度值。再利用以下公式計算含量：

2 結果與分析

2.1 叢生芽的生長

桑叢生芽在含有不同PEG濃度的MS培養基中生長情況有很大的差異（附圖1）。PEG濃度為1%時，組培苗生長基本正常；隨著PEG濃度升高，組培苗開始出現黃化葉片；當PEG濃度達到7%時，可以明顯看出PEG脅迫處理的組培苗比對照桑苗矮小，大多數葉片變黃；當PEG濃度增加到10%時，組培苗全部干枯死亡。

2.2 PEG脅迫對幼苗生理生化指標的影響

2.2.1 PEG脅迫對幼苗可溶性糖含量的影響

（1）可溶性糖標準曲線

圖1 可溶性糖標準曲線

（2）樣品中可溶性糖含量的變化

圖2 不同PEG濃度對叢生芽可溶性糖的影響

由以上圖表可得，在叢生芽的篩選過程中，隨著PEG濃度的增加，可溶性糖含量下降。PEG濃度1%、3%、5%下的可溶性糖含量相當，而PEG濃度7%下的含量下降幅度較大，只有對照組的54.67%。

2.2.2 PEG脅迫對幼苗脯氨酸含量的影響

（1）脯氨酸標準曲線

圖3 脯氨酸標準曲線

（2）樣品中脯氨酸含量的變化

圖4 叢生芽脯氨酸含量變化趨勢

由以上圖表可得，在苗期篩選的過程中，隨著PEG濃度的增大，脯氨酸含量隨之升高，在PEG濃度5%時達到最大值約55ug/g，在7%脯氨酸含量有所下降，但仍比對照組高。以對照組脯氨酸含量以指數100.00計，（PEG）1%濃度下的含量指數是其1.2737倍，（PEG）3%濃度下的含量為1.3012倍，而（PEG）5%濃度下的含量則達到1.9760倍，而（PEG）7%濃度下的含量只有對照組的1.4326倍。

2.2.3 PEG脅迫對于幼苗MDA含量的影響

（1）樣品中MDA含量的變化

由上圖可得，在苗期篩選過程中，隨著PEG濃度的增加，丙二醛含量曲折變化，先下降后上升，但各組值均低于對照組。以對照組脯氨酸含量以指數100.00計，（PEG）1%濃度下的含量指數是其52.23%，（PEG）3%濃度下的含量則低至其42.94%，而（PEG）5%濃度下的含量為其60.5%，而（PEG）7%濃度下的含量為對照組的77.96%。

3 討論

從本實驗結果看出，桑樹組織培養過程添加PEG模擬水分脅迫，桂優62桑叢生芽能抵抗的最大濃度為7%。隨著PEG濃度增加，叢生芽的可溶性糖含量增加；隨著PEG濃度的增大，脯氨酸含量隨之升高，這與其它方法鑒定抗水分脅迫的研究結果一致，但丙二醛含量呈現先下降后上升的曲線變化，并且添加PEG以后，丙二醛含量不同程度下降。相關研究顯示，細胞膜過氧化物丙二醛含量的高低與細胞膜的傷害程度一定程度上呈正相關關系，這說明叢生芽受到PEG脅迫后，細胞膜并沒有受到傷害，推測可能這些濃度的PEG脅迫還不足以引起細胞膜的傷害。從本次實驗結果來看，利用桑樹組織培養能初步分析鑒定桑樹受水分脅迫的部分生化指標，脯氨酸對水分脅迫最敏感，可溶性糖次之。

[1]王軍，馬雙馬，高玉軍，等.淺談桑樹在林業可持續發展中的優勢[J]，中國農學通報，2004，20（5）：72－73.

[2]秦儉，何寧佳，黃先智，等.桑樹生態產業與蠶絲業的發展[J]，蠶業科學，2010，36（6）：984－989.

[3]孫憲芝，鄭成淑，王秀峰.木本植物抗旱機理研究進展[J].西北植物學報，2007，27（3）：629－634.

[4]鄭光華，徐本美，顧增輝.PEG引發種子效果[J].植物學報，1985，27（3）：329－333.

[5]Hohl M，Schopfer P.Water relations of growing maize coleptile：Comparison between mannitol and polyethylene glycol6000as external osmotica for a djusting turgor pressure[J].Plant Physiol，1991，95（3）：716－722.

[6]Jackson W T.Use of carbowaxes（polyethylene glycol）as osmotic agents[J].Plant Physiol，1962，37（4）：513－519.

[7]王茜齡，余茂德，徐立，等.桑子葉與胚軸不同區段離體再生植株的研究[J].蠶業科學，2005，31（3）：334－337.

[8]王學奎.植物生理生化實驗原理和技術（第二版）[M].北京：高等教育出版社，2006：5.

[9]王三根.植物生理生化[M].北京：中國農業出版社，2008.

附圖1 叢生芽篩選情況