細胞色素C對慶大霉素致大鼠腎小管上皮細胞毒性的影響研究

李六水，高燕，李忠東#（1.安徽醫科大學藥學院，合肥3003；.空軍總醫院藥學部，北京10014）

慶大霉素是臨床上常用的氨基糖苷類抗生素（AGs）之一，廣泛用于革蘭陰性桿菌感染的治療，其主要作用特點是隨劑量的增加，其抗菌效果增強。目前，由于臨床上耐藥菌多見，慶大霉素等抗菌藥物的使用劑量越來越大，這無疑又加重了其不良反應的發生，如慶大霉素的腎毒性等。如何預防慶大霉素隨劑量增加所致的毒性增強，是藥物靶器官毒性防治領域的重要內容之一。細胞色素C（Cytochrome C）是從豬心中提取的含鐵卟啉的細胞呼吸激動藥，臨床上廣泛用于各種組織缺氧的急救或輔助治療，如一氧化碳中毒、安眠藥中毒、嚴重休克期缺氧以及肺部疾病引起的呼吸困難和心肌缺氧的治療等[1]。Watanabe A等[2]以同位素示蹤的方法發現，細胞色素C 0.8、8、80 mg·kg－1與低劑量慶大霉素0.1 mg·kg－1單次聯合給藥后2 h，大鼠腎臟中慶大霉素蓄積的量比對照組分別減少了約3.5%、35.7%、67.9%；細胞色素C 100 mg·kg－1可顯著降低慶大霉素30 mg·kg－1所致大鼠尿液中N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG）的量。由于目前慶大霉素的臨床用量越來越大，因此本研究在Watanabe A等研究基礎上，利用AxSYM全自動免疫分析儀，根據熒光偏振免疫發光技術（FPIA）原理測定了慶大霉素的含量，觀察細胞色素C 100 mg·kg－1對高劑量慶大霉素100 mg·kg－1單次給藥后在大鼠腎臟中蓄積量的影響，并觀察細胞色素C對慶大霉素致大鼠腎小管上皮細胞毒性的影響，為臨床應用提供實驗依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

MIAS醫學圖像分析系統（北京航空航天大學研究開發，由空軍總醫院孟如松教授提供，已獲北京市醫療器械準產許可證，注冊號:京藥管械（準）字2001第2210233號；已被廣泛用于圖像分析[3]）；AxSYM全自動免疫分析儀（美國Abbott公司）；DY89-Ⅱ電動玻璃勻漿機（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 試藥

細胞色素C注射液（安徽宏業藥業有限公司，批號:100944，規格:15 mg∶2 mL）；硫酸慶大霉素注射液（廣州白云山天心制藥股份有限公司，批號:101136，規格:8萬u∶2 mL）；AxSYM慶大霉素檢測試劑盒、AxSYM慶大霉素定標液、Ax-SYM慶大霉素質控液（美國Abbott公司，批號:93021、92476、90247）；脫氧核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端原位標記（TUNEL）細胞凋亡檢測試劑盒（瑞士羅氏公司，批號:12176400）。

1.3 動物

SPF級健康Wistar大鼠30只，♂，體重180～200 g，購于軍事醫學科學院實驗動物中心，動物許可證號:SCXK（軍）2007-004。

2 方法

2.1 分組與給藥

將所有大鼠分籠飼養，自由攝食與飲水，室溫25℃左右，相對濕度55%左右。經適應性飼養2 d后隨機分為溶媒對照組、慶大霉素組、慶大霉素+細胞色素C組，每組10只。溶媒對照組腹腔注射生理鹽水，慶大霉素組腹腔注射慶大霉素100 mg·kg－1·d－1，慶大霉素+細胞色素C組先尾靜脈注射細胞色素C 100 mg·kg－1·d－1，約30 min后腹腔注射慶大霉素100 mg·kg－1·d－1。

2.2 腎臟標本采集與處理

單劑量給藥后24 h處死大鼠，迅速剖腹摘取雙側腎臟，用生理鹽水洗凈表面殘血，并用濾紙吸干表面水分。每只大鼠的左腎稱重后加入生理鹽水，用組織勻漿機制備成6 mL的腎組織勻漿，用于測定腎臟中藥物濃度。每只大鼠右腎經縱切大致均分為2個部分，1/2用生理鹽水濕潤的紗布包裹后置于－20℃中儲存，用于細胞凋亡檢測；另1/2置于4%中性甲醛溶液中固定，用于組織病理學觀察。

2.3 腎組織中慶大霉素的含量測定

將制備好的腎組織勻漿置于振蕩器上渦旋混勻，取40 μL勻漿，加生理鹽水稀釋10倍，10 000 r·min－1離心10 min，取上清液置于AxSYM樣品杯中，以AxSYM全自動免疫分析儀測定腎組織中慶大霉素的含量，重復3次，并同時測定AxSYM慶大霉素高、中、低3個質控液濃度。如果3個質控液濃度均在允許范圍內，則樣品測定結果符合要求，然后將每組大鼠的檢測結果折算成每克腎組織含慶大霉素的質量（μg·g－1）。

2.4 腎小管上皮細胞凋亡情況

采用TUNEL法檢測各組大鼠腎小管上皮細胞凋亡，在400倍熒光顯微鏡（激發光波長450～500 nm）下觀察凋亡陽性細胞，呈現綠色顆粒狀細胞判定為凋亡陽性細胞。具體操作方法嚴格按照TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行。

2.5 腎小管上皮細胞凋亡圖像分析

在每張大鼠腎組織切片組織區域劃定一個大小幾乎相等的長方形亞區域，在4個角和中心區5個視野采集圖像，用MIAS醫學圖像分析系統計算陽性細胞數密度（單位統計場面積內凋亡陽性細胞數，陽性細胞數密度＝凋亡陽性細胞總個數/統計場總面積）。

2.6 腎組織病理學變化

將中性甲醛溶液固定的大鼠腎組織經梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋，切成5 μm厚的切片，行常規蘇木精-伊紅（HE）染色，在400倍光鏡下觀察各組大鼠腎組織病理學變化，每張切片選取5個不重疊視野，采集圖片觀察。

2.7 統計學方法

3 結果

3.1 慶大霉素的含量變化

結果表明，慶大霉素組大鼠腎組織中慶大霉素含量為（335.16±99.18）μg·g－1；慶大霉素+細胞色素C組大鼠腎組織中慶大霉素含量為（221.67±71.12）μg·g－1。與慶大霉素組比較，慶大霉素+細胞色素C組大鼠腎組織中慶大霉素蓄積量降低了33.86%（P＝0.043＜0.05）。

3.2 腎小管上皮細胞凋亡變化

結果表明，溶媒對照組TUNEL染色陽性細胞數較少，慶大霉素組TUNEL染色陽性細胞數明顯增多，慶大霉素+細胞色素C組較慶大霉素組TUNEL染色陽性細胞數有所減少。3組凋亡陽性細胞數密度分別為（111.26±95.35）、（637.78±169.64）、（404.75±135.57）n·mm－2。與溶媒對照組比較，慶大霉素組腎小管上皮細胞凋亡的陽性細胞數密度明顯增加（P＜0.01）；與慶大霉素組比較，慶大霉素+細胞色素C組腎小管上皮細胞凋亡的陽性細胞數密度減少了36.53%（P＜0.05）。各組大鼠腎小管上皮細胞凋亡的陽性細胞數密度比較見圖1。

圖1 各組大鼠腎小管上皮細胞凋亡的切片圖（×400）Fig 1 Slices chart of rat renal tubular epithelial cells apoptosis（×400）

3.3 腎組織病理學變化

結果表明，溶媒對照組大鼠腎組織結構清楚，腎小球無明顯充血或腫脹；慶大霉素組大鼠腎小管上皮細胞水腫、空泡變性，細胞刷狀緣脫落，腎間質內可見炎細胞浸潤，偶見腎小球充血腫脹；慶大霉素+細胞色素C組大鼠腎組織病變程度較慶大霉素組明顯減輕。各組大鼠腎臟組織病理學切片見圖2。

圖2 各組大鼠腎臟組織病理學切片（×400）Fig 2 Pathological slices of rat kidneys（×400）

4 討論

腎小管上皮細胞是慶大霉素毒性靶細胞[4]。Mouedden ME等[5]用TUNEL染色法和甲基綠-派洛寧染色法證實，慶大霉素10 mg·kg－1·d－1連續腹腔注射給藥4 d后，可以導致大鼠腎小管上皮細胞凋亡；劉冬娟等[6]通過給大鼠腹腔注射慶大霉素100 mg·kg－1·d－1，分別連續給藥5、8、10 d后，在透射電鏡下均觀察到腎小管上皮細胞凋亡。本研究以高劑量慶大霉素100 mg·kg－1·d－1單次腹腔注射給藥后，采用TUNEL法也明顯觀察到大鼠腎小管上皮細胞出現凋亡，提示腎小管上皮細胞凋亡可能是慶大霉素腎毒性的主要機制。

目前已證實，慶大霉素主要與腎小管上皮細胞膜表面的Megalin受體結合，然后通過胞飲方式進入并蓄積于腎小管上皮細胞內[7]。Megalin受體是一種低密度脂蛋白受體[2]，在腎小管上皮細胞表面大量表達[8]，其有多種配體，如多粘菌素B、胰島素、血紅蛋白、Ca2+、細胞色素C等[9]。Schmitz C等[10]發現，Megalin受體缺失型小鼠腎皮質中蓄積的慶大霉素的量僅為給藥劑量的0.6%，且胃腺癌細胞（AGs）與Megalin受體的親和力越大，則發生腎毒性的可能性越大，提示阻斷慶大霉素與該受體的結合即可抑制慶大霉素的腎毒性。

本研究通過測定大鼠腎臟中慶大霉素的藥物濃度，發現細胞色素C 100 mg·kg－1·d－1與高劑量慶大霉素100 mg·kg－1·d－1聯用后，腎組織中慶大霉素的蓄積量比單用慶大霉素減少了33.86%。此外，本研究還表明，細胞色素C與慶大霉素聯用后，腎小管上皮細胞凋亡的陽性細胞數減少了36.53%（P＜0.05），而且腎組織病理學變化有所好轉，表明其原因可能為外源性給予的細胞色素C抑制腎小管上皮細胞凋亡的程度與其阻斷腎組織中慶大霉素蓄積的程度相匹配；同時說明外源性給予的細胞色素C不能透過正常細胞的細胞膜[11]，不能進入細胞質誘導細胞凋亡，但結合并占據細胞膜表面的Megalin受體，從而競爭性地阻斷慶大霉素與Megalin受體的結合，使腎小管上皮細胞內慶大霉素的蓄積量減少。

總之，本研究從3個角度即腎組織藥物濃度測定、腎小管上皮細胞凋亡檢測和組織病理學觀察證明，細胞色素C可能通過抑制慶大霉素在大鼠腎臟中的蓄積來減輕其腎毒性。

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