羧氨基葡聚多糖鈉生物膠體液無菌檢查法的建立

陳 玲（貴州省藥品檢驗所，貴陽 550004）

羧氨基葡聚多糖鈉生物膠體液屬于殼聚糖類衍生物，為無色或微黃、澄明、略有黏性的滅菌液體，用于人體皮膚及創(chuàng)面的修復(fù)，具有保護組織纖溶酶原激活物活性，減少滲出，保護、隔離、潤滑組織創(chuàng)面及促進愈合的作用，是一種外用噴涂、濕敷、沖洗液[1]。該液具有黏性，動力黏度為1.2～3.0 mpa·s，且對生孢梭菌的作用較強，因此在建立無菌檢查方法時必須采用適宜的方法處理樣品液并消除其抗菌活性，以確保檢驗結(jié)果的準確性。為此，筆者根據(jù)《中國藥典》2010年版二部附錄無菌檢查法[2]，建立了該液的無菌檢查方法并進行了驗證。

1 儀器與材料

1.1 儀器

智能集菌儀HTY-2000A（杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司）；PY330一次性使用全封閉集菌過濾培養(yǎng)器（以下簡稱集菌器，常州市政政生化設(shè)備有限公司，批號:20100412）。

1.2 培養(yǎng)基

硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（批號:090104）、改良馬丁培養(yǎng)基（批號:090104）、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（批號:091124）、玫瑰紅納瓊脂培養(yǎng)基（批號:0909215）、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（批號:090125）均為北京三藥科技開發(fā)公司產(chǎn)品，試驗時均按要求[2]制備及滅菌。

1.3 菌種

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]、大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44102]、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]、生孢梭菌（Clostridium sporogenes）[CMCC（B）64941]、白色念珠菌（Candida albicns）[CMCC（B）98001]、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98003]均來源于中國食品藥品檢定研究院。

1.4 樣品

羧氨基葡聚多糖鈉生物膠體液（貴州揚生醫(yī)用器械有限公司，批號:20100701，規(guī)格:每瓶50 mL，含量:以D-鹽酸氨基葡萄糖計不低于1.3 mg·mL－1）。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品無菌檢查方法學驗證試驗

2.1.1 菌液的制備[2]。取經(jīng)35℃培養(yǎng)20 h的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物1 mL，生孢梭菌的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)物1 mL，分別用9 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液（以下簡稱溶劑）10倍逐級稀釋，制成10～100 cfu·mL－1的菌液，備用。

取經(jīng)25℃培養(yǎng)48 h的白色念珠菌改良馬丁液體培養(yǎng)物1 mL，用9 mL溶劑10倍逐級稀釋，制成10～100 cfu·mL－1的菌液，備用。

取經(jīng)25℃培養(yǎng)7 d的黑曲霉改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)物，加3～5 mL溶劑洗下霉菌孢子，吸取霉菌孢子懸液1 mL，用9 mL溶劑10倍逐級稀釋，制成10～100 cfu·mL－1的菌液，備用。

對所制備的菌液進行計數(shù)，結(jié)果見表1。

2.1.2 靈敏度檢查。取裝量為12 mL硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基9份，分別接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌各2份，另一份不接種，為陰性對照，置于30～35℃培養(yǎng)3 d；另取裝量為12 mL改良馬丁培養(yǎng)基5份，分別接種白色念珠菌、黑曲霉各2份，另一份不接種，為陰性對照，置于23～28℃培養(yǎng)5 d，逐日觀察。結(jié)果培養(yǎng)基的靈敏度檢查均符合規(guī)定，詳見表2（“+”:表示有菌生長；“-”:表示無菌生長，下表同）。

表1 菌落計數(shù)結(jié)果Tab 1 Results of bacterial colony count

2.1.3 方法學驗證Ⅰ[3]。取集菌器，第1個濾筒按薄膜過濾法濾過樣品5瓶，然后將相應(yīng)的培養(yǎng)基及試驗菌加入濾筒中，作為試驗管；第2個濾筒不濾樣品，直接加入相應(yīng)的培養(yǎng)基及試驗菌，作為陽性對照管；第3個濾筒直接加入相應(yīng)的培養(yǎng)基，作為陰性對照管。6種試驗菌同法操作，置于規(guī)定溫度培養(yǎng)3～5 d，逐日觀察，各試驗菌生長情況見表3。

表3 方法學驗證結(jié)果（Ⅰ）Tab 3 Results of methodology validation（Ⅰ）

表3結(jié)果顯示，方法學驗證Ⅰ中，直接薄膜過濾法驗證6種菌，生孢梭菌試驗管無菌生長，白色念珠菌試驗管到第5天才有少量菌生長，而其他4種菌無論試驗管還是陽性對照管都生長良好，說明樣品對生孢梭菌、白色念珠菌有抑菌作用，因此需進一步作驗證試驗。

2.1.4 方法驗證Ⅱ。針對被抑制試驗菌的情況，采用沖洗方法消除樣品對生孢梭菌、白色念珠菌的抑制作用。取集菌器，先用0.1%無菌蛋白胨水溶液浸濕濾筒，第1筒取樣品5瓶濾過，然后用500 mL 0.1%無菌蛋白胨水溶液分5次沖洗，沖洗時充分振搖，在最后一次的沖洗液中加入生孢梭菌菌液1 mL，濾過，抽干，然后加入相應(yīng)的培養(yǎng)基100 mL，作為試驗管；同時第2筒、第3筒為陽性、陰性對照管。白色念珠菌同法操作。置于規(guī)定溫度培養(yǎng)3～5 d，逐日觀察。結(jié)果，生孢梭菌試驗管仍未見菌生長，說明樣品對其仍有抑菌作用。各試驗菌生長情況見表4。

2.1.5 方法驗證Ⅲ。針對被抑制生孢梭菌的情況，采用加熱沖洗液沖洗的方法以消除樣品對生孢梭菌的抑制作用，其中沖洗液取量分別為500、800 mL。

表4 方法學驗證結(jié)果（Ⅱ）Tab 4 Results of methodology validation（Ⅱ）

取集菌器，先用加熱至45℃的0.1%無菌蛋白胨水溶液浸濕濾筒，第1筒取樣品5瓶濾過，用每膜500 mL、加熱至45℃的0.1%無菌蛋白胨水溶液分5次沖洗，沖洗時充分振搖，在最后一次的沖洗液中加入生孢梭菌菌液1 mL，濾過，抽干，然后加入相應(yīng)的培養(yǎng)基100 mL，作為試驗管；第2、3筒為陽性、陰性對照管。另取集菌器同法進行試驗，只是沖洗液取量為800 mL。置于規(guī)定溫度培養(yǎng)1～3 d，逐日觀察，試驗菌生長情況見表5。

表5 方法學驗證結(jié)果（Ⅲ）Tab 5 Results of methodology validation（Ⅲ）

方法驗證Ⅲ結(jié)果說明，采用加熱至45℃的0.1%無菌蛋白胨水溶液500、800 mL沖洗，均可消除樣品對生孢梭菌的抑制作用。

2.2 樣品無菌檢查

確定羧氨基葡聚多糖鈉生物膠體液無菌檢查方法為:取集菌器，先用加熱至45℃的0.1%無菌蛋白胨水溶液浸濕，取樣品5瓶，濾過，用加熱至45℃的0.1%無菌蛋白胨水溶液500 mL（每膜），分5次沖洗，再將相應(yīng)的培養(yǎng)基100 mL加入濾筒內(nèi)，以生孢梭菌為陽性對照菌，同時設(shè)立陰性對照，按規(guī)定溫度培養(yǎng)14 d，逐日觀察、記錄。取樣品按照上述方法進行驗證試驗，結(jié)果見表6。

表6 樣品無菌檢查驗證試驗結(jié)果Tab 6 Sterility validation test results of sample

表6結(jié)果顯示，羧氨基葡聚多糖鈉生物膠體液采用加熱至45℃的0.1%無菌蛋白胨水溶液500 mL沖洗（每膜），完全能消除其對生孢梭菌的抑制作用，試驗管中各試驗菌均生長良好，可作為羧氨基葡聚多糖鈉生物膠體液的無菌檢查方法。

羧氨基葡聚多糖鈉生物膠體液為貴州揚生醫(yī)用器械有限公司生產(chǎn)，報貴州省藥品檢驗所注冊檢驗，該樣品為上市制劑。目前未見有關(guān)該類外用沖洗液無菌檢查方法的報道。根據(jù)《中國藥典》相關(guān)要求[2]，羧氨基葡聚多糖鈉生物膠體液屬非注射產(chǎn)品，批產(chǎn)量＞200，每種培養(yǎng)基最少檢驗數(shù)量為10個，因此取樣品60瓶，按上法作6種菌的無菌檢查試驗，結(jié)果見表7。

表7 批產(chǎn)量樣品無菌檢查法驗證結(jié)果Tab 7 Results of sterility validation of batch production of samples

表7結(jié)果顯示，按批出廠產(chǎn)品最少檢驗數(shù)量為10個，而上市抽驗樣品的最少檢驗數(shù)量為5個，雖然批出廠產(chǎn)品檢驗數(shù)量是上市樣品檢驗數(shù)量的2倍，但在檢驗過程中使用加熱后的沖洗液浸潤濾膜，且沖洗分5次，沖洗時要充分振搖，同樣能消除樣品的抑菌作用。

3 討論

根據(jù)《中國藥典》2010年版二部附錄無菌檢查法的要求[2]，薄膜過濾法為首選方法。薄膜過濾法采取封閉式集菌，供試品取量大，不易漏檢，抽濾前的消毒及無菌操作也容易控制，故本試驗選擇薄膜過濾法。

羧氨基葡聚多糖鈉生物膠體液具有一定的抗菌作用，且具黏性，無菌檢查時，必須采用加熱至45℃的沖洗液沖洗，此溫度沖洗液沖洗樣品，既不會使濾膜上的微生物受損傷，又能消除其抑菌作用。

[1]貴州揚生醫(yī)用器材有限公司.羧氨基葡聚多糖鈉生物膠體液說明書[S].2010.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）[S].2010年版.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄103-107.

[3]郭朝暉，何曉英，歐陽曉玫.注射用夫西地酸鈉無菌檢查方法的建立及驗證[J].中國藥房，2011，22（5）:453.