啤酒釀造廢酵母H2O2氧化脅迫下細胞衍生物的研究

朱益波，朱明，朱雪

（1.常熟理工學院生物與食品工程學院，江蘇常熟 215500；2.大富豪（常熟）啤酒有限公司，江蘇常熟 215500）

啤酒釀造廢酵母H2O2氧化脅迫下細胞衍生物的研究

朱益波1，朱明2，朱雪1

（1.常熟理工學院生物與食品工程學院，江蘇常熟 215500；2.大富豪（常熟）啤酒有限公司，江蘇常熟 215500）

為更好地利用大量的廢啤酒酵母資源，研究了廢酵母在H2O2氧化脅迫下形成的活酵母細胞衍生物（LYCD）的活性，優化了脅迫條件.研究結果表明：廢酵母細胞經終濃度0.2 mmol/L H2O2脅迫15 min形成的促細胞生長活性最高，超氧化物歧化酶（SOD）活力是對照的18倍，丙二醛（MDA）含量約為對照的40%；SOD的活力與MDA含量呈現大致的反比關系；脅迫30 min，LYCD中還原型谷胱甘肽（GSH）是對照的2.7倍；活性物質的最高值并未在相同的脅迫條件下出現.

啤酒廢酵母；活酵母細胞衍生物；氧化脅迫

酵母細胞在受到應激脅迫，比如紫外照射、高低溫、氧化壓力等刺激時，會啟動多種應激機制產生多種活性物質以抵御不良環境的刺激[1].有學者將這些物質稱為活細胞酵母衍生物（LYCD）[2]，對于LYCD的研究表明，它主要由氨基酸、單糖、雙糖、維生素和礦物質等活性物質組成.LYCD的應用研究表明其具備促進膠原和彈性蛋白的產生、加速傷口愈合的功能[3]，以及能增加皮膚細胞中的新生蛋白質對水分吸收和促進細胞線粒體對氧的利用，使細胞的呼吸和能量代謝過程更為有效，因此LYCD在化妝品領域具有廣闊的應用前景[4].目前國內關于LYCD的應用和機理研究主要側重于應激培養條件對酵母細胞衍生物中相關活性成分的影響[4-8]，以及活性物質中多糖的純化和結構測定[9].我國現在已經是啤酒生產和消費大國，每年大量的啤酒廢酵母沒有得到綜合利用而造成嚴重資源浪費和環境污染.目前關于利用啤酒廢酵母細胞生產LYCD的研究還較少，主要是張健等人研究了廢啤酒酵母在含重金屬廢液中培養啤酒酵母生產LYCD的工藝[10].本文旨在研究新鮮啤酒廢酵母在H2O2的氧化脅迫下，活細胞衍生物的活性物質變化規律，摸索最適作用條件，為利用氧化壓力脅迫啤酒廢酵母生產LYCD提供參考依據.

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

釀酒酵母：實驗室保存，用于LYCD活性測定.

廢啤酒酵母：大富豪（常熟）啤酒有限公司提供發酵后期沉降酵母，收集分裝于無菌三角瓶后待用；

培養基：馬鈴薯培養基（PDA）；

試劑：30%H2O2；無水乙醇；冰醋酸；鄰苯二甲醛；連苯三酚；還原型谷胱甘肽；三氯乙酸；MDA測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）.

1.2 主要儀器與設備

JY-98-Ⅲ超聲波細胞粉碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；島津RF-5301PC型熒光分光光度計；島津UV-2550型紫外-可見光分光光度計；培養箱；水浴搖床；冷凍離心機.

1.3 方法

1.3.1 啤酒廢酵母預處理

新收集的啤酒廢酵母懸浮于預冷的無菌生理鹽水，洗滌三次除去吸附于酵母表面的雜質.取清洗后的酵母細胞懸液25 ml分裝于50 ml無菌離心管中，4℃、5000 r/min離心10 min，去上清液后冷藏保存待用.

1.3.2 H2O2半數致死濃度的測定

取一定量廢啤酒酵母細胞懸液，加入一定量的H2O2，使其作用終濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.6、2.0、2.5 mmol/L，28℃，150 r/min培養30 min后，樣液用無菌生理鹽水（0.9%）稀釋相應倍數后，傾注培養計數法測定H2O2作用前后的活菌數量，計算存活率.以酵母細胞約50%致死時的H2O2濃度作為H2O2對酵母細胞的半數致死濃度.

1.3.3 LYCD的制備和活性測定

LYCD制備：取一定量廢啤酒酵母細胞懸液，加入H2O2至相應濃度，28℃，150 r/min脅迫一定時間，離心（3500 r/min，10 min）收集菌體，并用無菌水洗滌一次，然后加入適量的馬鈴薯葡萄糖液體培養基，同上條件培養3 h，離心（3500 r/min，10 min）收集菌體，冰浴超聲波破壁（工作時間3 s，間隙時間5 s，400 W，工作次數60）并用4℃的無菌水轉移破碎物，經10000 r/min離心5 min后，取上清液，即為該H2O2脅迫作用條件下的LYCD.對照酵母細胞提取物（YE）除不進行氧化脅迫外其余操作同上.

LYCD活性測定：取一定體積培養到對數期的釀酒酵母細胞懸液，加入等體積的LYCD和馬鈴薯葡萄糖液體培養基，28℃，150 r/min培養1 h，測定培養前后OD256的變化，以此間接反映LYCD活性的大小.

1.3.4 LYCD中谷胱甘肽（GSH）含量測定

取新鮮制備的LYCD或YE，然后按照體積比1：10加入三氯乙酸（TCA），混勻，在冷藏箱內放置60 min，10000 r/min離心5 min，上清液即為所需的樣品.然后按照文獻[11]描述的方法測定GSH的含量.

1.3.5 LYCD中SOD酶活力測定：鄰苯三酚自氧化法[12]

酶活性單位的定義為：每分鐘抑制連苯三酚自氧化速率達50%時的酶量定義為一個活性單位.

1.3.6 LYCD中MDA的測定

參照MDA測定試劑盒中說明書進行.

2 結果與分析

2.1 H2O2脅迫最適條件分析

2.1.1 H2O2對廢啤酒酵母半數致死濃度

為考察H2O2對于廢啤酒酵母細胞的毒性，進而確定大致的處理濃度范圍，故首先考察了在脅迫30 min下，處理濃度與酵母細胞存活率的關系.廢啤酒酵母細胞存活率與H2O2處理濃度的關系如圖1所示.由圖可見隨著加入H2O2濃度由0增加到0.8 mmol/L時，菌體的存活率迅速下降.當H2O2的作用濃度為0.6 mmol/L時細胞的存活率僅為44%，說明該處理濃度接近H2O2對酵母細胞的半數致死濃度.此實驗結果表明相關處理濃度應該低于該半數致死濃度.

2.1.2 H2O2作用濃度及時間的優化

選用不同濃度（0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mmol/L）的H2O2作用于廢酵母懸液，作用時間為30 min，離心終止作用后制備LYCD.然后測定其活性，實驗結果見圖2a.當作用濃度為0.2 mmol/L時所引起的酵母培養液的△OD256的值為0.375，達到最大值，即此時產生的LYCD的活性最強，所以，實驗確定H2O2的最佳作用濃度為0.2 mmol/L.

然后以0.2 mmol/L的H2O2作用于廢酵母懸液，作用時間分別為0、15、30、45、60 min，離心終止作用后制備LYCD.測定其活性，實驗結果見圖2b.處理時間為15 min提取的LYCD顯著促進了酵母細胞培養液OD256的增加，達到了0.4，是對照樣品的1.55倍.處理時間增加，促進效果開始下降，當時間延長到45 min時，獲得的LYCD的相對活性和對照相當，說明過長時間處理對于LYCD的活性有顯著影響，這可能與過長時間處理使得廢啤酒酵母細胞大量死亡，無法產生抗逆性活性物質有關.另有研究表明當酵母細胞暴露于亞致死量外源H2O2中時，細胞膜會隨著H2O2的適應性反應迅速發生變化，改變膜的成分，使膜的通透性發生改變，從而形成跨膜梯度，提高細胞對H2O2的耐受性[13].故也有可能是由于細胞膜成分改變導致跨膜梯度形成減少了H2O2對細胞的損害.綜合圖2的結果可認為H2O2處理濃度為0.2 mmol/L，處理時間15 min到30 min獲得的LYCD活性較高.

圖1 H2O2處理濃度對酵母細胞存活率影響

圖2 處理濃度與時間對LYCD的影響

2.2 LYCD中活性物質的測定

2.2.1 GSH含量測定標準曲線及LYCD中GSH含量分析

配制好的標準溶液，室溫放置40 min后，進行熒光強度的測定（40 min到70 min內進行測定，數據標準偏差最小，數據未列出）.以標準溶液的濃度為橫坐標，熒光強度值為縱坐標，繪制標準曲線如圖3所示.得線性回歸方程為：Y=52.702X-0.2832，R2=0.999.標準曲線表明GSH的濃度在0.08 ug/mL到0.72 ug/mL之間時，其濃度與熒光強度值有很好的線性關系，可以作為計算樣品中GSH含量的依據.

將0.2 mmol/L H2O2處理相應時間后新鮮制備的LYCD和YE經適當稀釋，按照標準曲線的測定方法測定樣品中GSH含量，所得結果如圖4所示.由圖可以看出0.2 mmol/L H2O2刺激30 min時，LYCD中的GSH含量高達15.2 ug/mL，而對照YE中的GSH含量僅為5.7 ug/mL（圖中未列出），脅迫后細胞提取物中的GSH含量均高于對照YE中的GSH含量（即使作用時間60 min對應的GSH含量降低到7.1 ug/mL也明顯高于對照的5.7 ug/mL）.即經過H2O2刺激產生的酵母衍生物LYCD中的GSH含量要顯著高于未經H2O2刺激處理的細胞提取物YE.眾多研究表明，GSH具有抗氧化和清除體內自由基的功能.細胞在氧化及其他環境壓力下會啟動相應保護機制維持胞內穩定的氧化還原環境，而GSH就是其中一種非常重要的物質[14].本研究的結果表明廢啤酒酵母細胞經過H2O2的脅迫，也可以通過激活體內的抗性機制產生GSH來抵御外界氧化壓力.另外，在刺激時間為30 min時，GSH的含量要顯著高于其他作用時間所產生的量，這可能是基于以下兩個原因：一是該測定方法是測定還原型谷胱甘肽的含量，而在脅迫下可能一部分還原型谷胱甘肽已經變成氧化態，從而不能檢測出；二是脅迫時間過短可能在細胞做出響應時，環境壓力突然消失，而脅迫時間過長，細胞存活率低而導致GSH含量下降.具體是什么原因還需要進一步的實驗加以驗證.

2.2.2 LYCD中SOD活性分析

測定上述制備的LYCD中SOD總酶活，結果見圖5.在H2O2脅迫不同時間后，細胞衍生物中SOD酶活性發生顯著變化：脅迫10 min和15 min，SOD總活力分別迅速增加為對照的約14和18倍，刺激15 min制備的LYCD中SOD活力達到了最大值；脅迫時間超過15 min，細胞內的SOD活力又逐漸下降，刺激60 min，SOD總活性下降至僅有30 U左右.

有研究表明外源添加H2O2可以直接作用于細胞蛋白質或者跨過細胞膜后進一步與亞鐵離子反應產生自由基，進而對胞內的蛋白質甚至DNA產生傷害[15].LYCD中SOD酶活性的顯著變化表明細胞經H2O2的脅迫后，在細胞內產生大量自由基，并誘導了細胞內編碼SOD基因的表達以消除脅迫產生的超氧陰離子自由基.而對于不同脅迫時間下SOD酶活性的變化原因可能與前面的分析類似.從圖2，圖4和圖5的結果來看，SOD最高值出現在脅迫15 min后，GSH最高值為脅迫30 min后，而LYCD活力在脅迫15 min～30 min都維持在比較高的范圍內.這一結果表明在不同的脅迫時間，細胞內抗氧化脅迫物質呈動態變化，GSH的含量和SOD的活力都是LYCD活力的組成部分.

2.2.3 LYCD中MDA含量分析

圖3 熒光法測定GSH含量標準曲線

圖4 處理時間對LYCD中GSH含量的影響

圖5 處理時間對LYCD中SOD活性的影響

對于LYCD中MDA含量的測定結果見圖6.從圖可以看出，經0.2 mmol/L H2O2脅迫后的LYCD中的MDA含量明顯要少于未經脅迫細胞提取物中的MDA含量.MDA是自由基作用于脂質發生過氧化反應的產物，通過MDA含量可以間接地反映機體受自由基損傷的程度，而SOD的活性則可間接地反映機體清除自由基的能力，結合圖5可以看出，LYCD中的MDA含量與SOD的活性呈大致的反比關系，即在SOD的活性較高時MDA的含量較低，這也間接表明在H2O2脅迫下酵母細胞氧化應激反應主動地產生了抗氧化成分如SOD等來清除氧自由基以保護細胞免受氧化傷害.脅迫15 min時這種應激反應清除氧自由基的程度最大，此時MDA含量最少，約只有對照MDA含量的40%，這一點與此處理產生的SOD活性最強的結論是吻合的.

圖6 處理時間對LYCD中MDA濃度的影響

3 結論

通過對LYCD中MDA、GSH和SOD這兩種抗氧化成分結合LYCD活性的研究分析結果可得出以下結論：

（1）廢啤酒酵母細胞在終濃度0.2 mmol/L H2O2環境中脅迫15 min，細胞產生的LYCD的活性最高；

（2）采用0.2 mmol/L H2O2脅迫廢啤酒酵母細胞30 min，細胞在氧化應激反應中形成的GSH含量最高，約為對照的2.7倍；脅迫15 min，細胞內SOD活力最高，約是對照的18倍，對應的MDA含量只有約對照的40%；

（3）MDA含量與LYCD中SOD總活性大致呈反比關系，這表明SOD消除了氧自由基，進而減少了MDA的產生；

（4）LYCD的活性是各種應激活性成分（如GSH、SOD、多種活性蛋白和多糖等）所產生的綜合效果，在氧化應激反應中，各活性成分并非同時達到活性最高值.

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A Study on Cell Derivative of Waste Beer Yeast under H2O2Oxidative Stress

ZHU Yi-bo1,ZHU Ming2,ZHU Xue1
(1.School of Biotechnology and Food Engineering,Changshu Institute of Technology,Changshu 215500,China; 2.Dafuhao Brewery(Changshu)Ltd.,Changshu 215500,China)

For the purpose of utilizing abundant waste yeast resource,the activity of living yeast cell derivative (LYCD)from yeast cell under H2O2oxidative stress was studied.Results showed that:the activity of LYCD reached peak level after 15-minute stress with final concentration 0.2 mmol/L H2O2;Superoxide dismutase (SOD)activity was 18 times as high as that of the control,whereas malonaldehyde(MDA)concentration was about 40%of that in control;SOD activity and MDA concentration presented inverse ratio relationship;Reduced glutathione concentration was 2.7 times as high as that of control after 30-minute stress with final concentration 0.2mmol/L H2O2;The active substances in LYCD did not simultaneously reach the highest level.

waste yeast;living yeast cell derivative;oxidative stress

Q939.97

A

1008-2794（2012）10-0065-05

2012-09-15

江蘇省高校自然科學研究計劃資助項目“新型非降解技術提取啤酒酵母β-D葡聚糖的工藝研究”（08KJD180006）

朱益波（1980—），男，江蘇靖江人，講師，博士，研究方向：基因工程與發酵工程．