納米粒的主動靶向修飾在腫瘤治療中的研究進展

何玉芳，范 青

(大連醫科大學 附屬第二醫院 藥劑科，遼寧 大連 116027)

隨著納米粒制備技術的發展，其在抗腫瘤中的研究也越來越廣泛。納米粒在抗腫瘤中的優勢主要如下：(1)靶向作用，納米粒本身具有一定的被動靶向作用，因為在正常組織的血管中，兩個內壁細胞之間的距離約為2 nm，而在腫瘤血管中，兩個內壁細胞之間的距離為100～150 nm，這就導致了腫瘤組織的“高通透性與滯留”效應(EPR-effect)，抗腫瘤納米粒的粒徑一般為10～150 nm，具有超強的滲透力，可以滲透入腫瘤組織中并蓄積，對于腫瘤多藥耐藥(multidrug resistance， MDR)有一定的意義，這是納米粒在抗腫瘤中最突出的優勢；(2)采用具有生物適應性及可生物降解的材料作為載體，如聚乙丙交酯(PLGA)、殼聚糖、腦磷脂等，進入體內后不會引起機體免疫反應并且能生物降解，對人體的毒副作用很低；(3)可控制藥物的釋放，這跟粒徑也有一定關系，粒徑較小的納米粒，釋放較快，粒徑較大的則釋放較慢[1]；(4)增加難溶性藥物的溶解度，提高生物利用度；(5)可改變藥物的藥代動力學特性，延長某些藥物的半衰期；(6)表面積大，因而載藥量較高。

然而納米粒仍然有些缺陷，它易被網狀內皮系統(RES)吞噬，在還沒達到靶向部位時，就在RES分布較廣的肝、脾等器官蓄積，半衰期較短，所以需要對納米粒進行適當的修飾，以避免RES的吞噬作用。

腫瘤組織與正常組織的生理、物理狀態有很大差異，根據這些差異對納米粒載體材料或其表面進行適當修飾可以將其制成主動靶向納米粒，直接靶向腫瘤組織，減小對正常組織的損傷。目前應用較多的有如下幾類。

1 受體介導類

這類受體都是天然受體，因為腫瘤細胞不斷增殖，需要補充大量促進生長的物質，如維生素、鐵離子等，此外腫瘤組織的轉移、血管增生等也會上調相關受體的表達水平，配體與受體的結合有著高度特異性與親和力。納米粒通過受體介導的內吞作用進入細胞。

1.1 葉酸(folic acid，FA)

葉酸對細胞的分裂、增殖，以及某些生物大分子的合成、代謝有著重要的作用。腫瘤細胞不斷增殖，需要大量葉酸，在腫瘤組織尤其是子宮、乳腺、腦、肺、腎癌細胞中會高表達葉酸受體(Folate receptor，FR)[2]，而在正常組織中低表達或不表達。并且在癌細胞中表達的葉酸受體多為α-FR，對游離的葉酸具有很強的親和力，葉酸與大分子物質共價結合后，仍然可以像游離的葉酸一樣與腫瘤細胞中的葉酸受體緊密結合；而在正常細胞中表達的多為β-FR[3]，該受體優先與5-甲基四氫葉酸結合，因此將葉酸偶聯到納米粒中可產生主動靶向作用。另一方面，葉酸無毒，分子量低，具有較低的免疫原性，價格便宜，所以葉酸是一種比較理想配基。

Ulbrich K等[3]制備了葉酸-人血清白蛋白納米粒(HAS-NPs)，體外實驗將該納米粒作用于人成神經細胞瘤UKF-NB-3，大鼠惡性膠質瘤101/8以及人包皮成纖維細胞HFFs中，結果顯示未經FA修飾的HAS-NPs在三種細胞中的攝入無明顯差異，而經FA修飾后的FA-HAS-NPs在腫瘤細胞UKF-NB-3與101/8中的攝入增多而在正常細胞HFFs中的攝入減少，體現了葉酸對腫瘤細胞的選擇性。而Zhang ZW等[4]通過谷胱甘肽(GSH)將FA與金-納米粒(GNPs)偶聯，制備的FA-GSH-GNPs粒徑為(36.4±4.2) nm，在FR高表達的Hela細胞中攝入較高，而在FR水平較低的A549細胞中攝入較低，這說明葉酸對腫瘤的選擇性不只存在于腫瘤與正常組織之間，對于不同的腫瘤，葉酸也有一定的選擇性。

1.2 黃素單核苷酸(flavin mononucleotide，FMN)

黃素單核苷酸的原型為核黃素(Riboflavin，Rf)，即維生素B2，對于細胞的新陳代謝有著重要的作用。在新陳代謝旺盛的細胞如腫瘤、激活狀態的內皮細胞中會高表達核黃素載體蛋白(Riboflavin carrier protein，RCP)，能與Rf結合，并將其轉移至細胞內。此外，FMN發出的綠色熒光，可以賦予納米粒標記腫瘤的作用。

Jayapaul J等[5]用FMN包裹超微型超順磁性氧化鐵(USPIO)核制備的納米粒(FLUSPIO)，體外實驗通過透射電鏡、質譜顯示在人前列腺癌細胞PC3與人臍靜脈內皮細胞HUVEC中FLUSPIO的攝入明顯高于USPIO，并且細胞在經過FLUSPIO孵育30 min和1 h后，R2弛豫率明顯高于經過USPIO孵育的效果。

1.3 轉鐵蛋白(transferrin，Tf)

轉鐵蛋白對于維持體內鐵離子的平衡至關重要，去鐵轉鐵蛋白(Apotransferrin)與鐵離子結合后形成Tf，然后與轉鐵蛋白受體(TfR)結合，通過內吞作用進入細胞[6]。TfR在多種腫瘤細胞高表達，如膀胱癌過渡細胞、乳腺癌、神經膠質瘤、肺腺癌、慢性淋巴白血病、非霍奇金淋巴瘤等[7]。此外，Tf本身也可作為納米粒的載體。Wang J等[8]將Tf的抗體OKT9與PRINT?nanoparticles結合，以IgG1-PRINT?為對照組，作用于4類細胞中，其TfR表達水平如下Ramos > HeLa ≈ H460 > HEK293，經檢測胞內納米粒濃度，發現在實驗組中，其胞內濃度高低與TfR的表達水平高低一致，而在對照組則沒有這一趨勢。 Hong MH等[9]制備了Tf-PEG-NPs作為羥基喜樹堿的載體，組織分布實驗將各組藥物分別作用于TfR高表達的S180肉瘤移植小鼠，結果Tf-PEG-NPs在腫瘤組織中的濃度是最高的，是PEG-NPs的2.47倍。這說明不論是TfR的抗體還是Tf，都具有對腫瘤的靶向性。

1.4 表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)

表皮生長因子能強烈刺激上皮細胞的生長，對于腫瘤的發生亦有促進作用。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)能與EGF、轉化生長因子等多種配基特異性結合，在正常組織中也有表達，但在腫瘤組織中的表達遠遠高于正常組織，主要存在于乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌以及神經纖維瘤的細胞中[10]，尤其是發生轉移或產生多藥耐藥的腫瘤細胞。EGFR的異常會對細胞產生誤導作用，導致細胞不停生長。將EGF對納米粒進行修飾同樣可以賦予其主動靶向性。目前利用EGFR產生主動靶向的方式有很多，如EGFR抗體、EGFR肽等。

Milane L等[11]制備了氯尼達明(LON)與紫杉醇(PTX)的載藥納米粒PLGA-PEG-EGFR肽-NPs，得到主動靶向納米粒。經小鼠尾靜脈注射后測定各藥代動力學參數，PTX溶液組在腫瘤中的半衰期T1/2為(1.31±1.00) h，被動靶向NPs將其延長至(5.92±2.49) h，而主動靶向NPs則延長至(8.24±2.16) h；LON溶液組與納米粒組分別在給藥1 h和3 h后達到腫瘤組織中的Cmax，其中LON溶液組Cmax為(1.15±0.99) μg/mL，被動靶向NPs為(5.68±1.30) μg/mL；主動靶向NPs為(7.38±1.84) μg/mL。說明經過EGFR肽修飾后化療藥物具有更好的藥代動力學特性。Sandoval MA[12]將EGF與硬脂酰-吉西他濱-納米粒(GemC18-NPs)共價結合，以白蛋白(OVA)-GemC18-NPs為對照組。體外實驗結果發現EGFR受體表達水平依次增高的細胞，其細胞攝入也依次增高。在小鼠腫瘤模型中，EGF-NPs在腫瘤組織中的蓄積比OVA-NPs高了2倍，對腫瘤有著較強的選擇性。因此，無論是從藥代動力學還是對腫瘤靶向性的角度來看，EGFR都有一定優勢。

2 多肽類

此類多為人工合成多肽，這些多肽可與特定受體的某個結合域結合，或者干擾配體與受體的結合，也有較強的親和力。

2.1 RGD肽

腫瘤增殖的同時，會生成大量新的血管，為其輸送養料。整聯蛋白αvβ3是細胞的一種黏附分子，在多種腫瘤細胞中高表達，對腫瘤新生血管與轉移有著舉足輕重的作用。整聯蛋白αvβ3中有一個RGD肽(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)結合域，可與RGD肽穩定結合[13-14]，用RGD肽制備納米粒，可靶向腫瘤血管內皮細胞。

Danhier F等[14]用RGD修飾了包裹抗腫瘤藥JNJ-7706621的納米粒，體內實驗中， JNJ-7706621溶液組處理的肝移植瘤小鼠平均生存期為9.8 d，被動組為15.3 d，RGD-NPs組延長為16.8 d，且差異具有統計學意義。說明納米粒尤其是RGD-NPs能明顯延緩腫瘤的生長。

2.2 K237肽

血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)與細胞的遷移、入侵、血管形成及血管通透性有關，在腫瘤新生血管的內皮細胞高表達，而在其鄰近的正常組織幾乎不表達[15]。VEGF主要有四類受體：VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR-2(KDR/Flt-1)、NRP-1 和 NRP-2。其中已確定KDR/Flt-1在腫瘤血管形成中發揮了主要的調節作用，VEGF與KDR結合后，能刺激血管內皮細胞增殖。K237肽是從噬菌體中分離出來的小分子多肽，與KDR有著高度的親和力，可以干擾VEGF-KDR的結合。另外，K237肽對移植的實體瘤有著明顯的抑制作用。

Yu DH等[16]制備了K237-PTX-NPs，體內實驗給MDA-MB-231乳腺癌移植瘤裸鼠注射熒光標記的NPs，2 h后，該納米粒到達腫瘤血管，相反，不含K237的NPs并沒有到達腫瘤血管，而是滲透到了腫瘤的軟組織中。因此K237對于腫瘤血管的靶向有著一定的引導作用。

2.3 YIGSR 肽

層粘連蛋白受體(laminin receptor)在肺癌轉移性細胞中高表達，而YIGSR肽可以特異性結合該受體， Sarfati G等[17]將YIGSR肽通過羧基團與聚合物納米粒表面結合，制備了靶向肺癌轉移細胞的納米粒。體內實驗證明該納米粒在肺正常組織中的蓄積量與其他肽修飾的納米粒無明顯差別，而在肺轉移細胞中的蓄積量比其他肽高5倍，并且沒有心臟、肝、肺的趨向性。

3 黏多糖類

某些糖類的受體在腫瘤細胞的表達水平高于正常細胞，所以糖類也具有腫瘤靶向性。糖類包括單糖和多糖，其中常用于靶向修飾的單糖有乳糖、甘露醇等；多糖多為黏多糖，如肝磷脂、透明質酸等，主要與腫瘤細胞的遷移有關。

3.1 肝磷脂(heparin，HeP)

肝磷脂也叫肝素，是由重復的硫基化二糖單位組成的負電荷線型黏多糖，具有抗凝集、抗炎、抗血管再生、抗腫瘤增殖等作用，并且肝素與不同轉錄因子作用后會產生促凋亡的活性。轉移性的癌細胞會高表達肝素酶與類肝素酶，使肝磷脂降解，以便于細胞的遷移[18-19]。

Lee K等[18]用熒光染料標記肝磷脂用于修飾金-納米粒的表層，體外實驗用轉移性高的宮頸癌細胞Hela、轉移性低的乳腺癌細胞MCF-7以及非腫瘤細胞系NIH3T3，RT-PCR檢測三者的類肝素酶水平依次降低，經過熒光分光光度計檢測，細胞內熒光強度也依次降低，說明肝素對轉移性的腫瘤細胞有更強的靶向性。

3.2 透明質酸(hyaluronic acid，HA)

透明質酸也叫玻尿酸，其在納米粒中的應用主要在于他可以結合CD44，而CD44的表達與腫瘤的遷移有著顯著的相關性，用HA對納米粒表面進行修飾，不僅可以產生靶向作用，還可使癌細胞對抗腫瘤藥物更敏感。

Cho HJ等[20]將HA與神經酰胺(CE)結合，并加入普朗尼克F85，與其他共聚物制備了多西他賽載藥納米粒，體外實驗將香豆素-6標記的納粒作用于CD44表達較低的U87-MG細胞和CD44表達較高的MCF-7細胞，在激光共聚焦顯微鏡下觀察，發現在MCF-7細胞內，其熒光強度明顯強于U87-MG，而用游離HA干擾后，MCF-7內熒光強度明顯減弱，導致這一結果的原因無疑是HA與CD44的結合作用。

4 抗體類

抗體介導類主要依靠抗原抗體的特異性結合，將納米粒靶向特定組織，腫瘤抗體是近年來的一個研究熱點，靶向制劑也隨之掀起了抗體靶向的潮流。

4.1 單鏈抗體片段(ScFvs)

單鏈抗體片段在抗腫瘤納米粒中的應用也比較廣泛，他的優勢在于：(1)分子量小，其大小只有IgG抗體的1/5，但卻保留了充分的抗原結合能力，所以即便與納米粒結合，也能使其保持在較小的粒徑范圍內；(2)不含Fc連續片段，所以不足以產生有害的免疫反應；(3)容易獲得。Vigor KL等[21]用癌胚抗原(CEA)的特異性scFv修飾SPION-NPs，將該納米粒與被動組作用于CEA陽性表達的結腸癌細胞LS174T與CEA陰性的黑色素瘤細胞A375M，激光共聚焦顯微鏡下觀察，scFv-SPION-NPs能特異性靶向CEA陽性細胞。通過MRI測定了T2弛豫率的減少百分率，CEA陽性細胞明顯大于CEA陰性細胞，進一步證明了scFv對CEA的特異性。

4.2 AMG 655

AMG 655是死亡受體(death receptor，DR5)的單克隆抗體，DR5是腫瘤壞死因子受體超家族中的一員，在結腸、胰腺癌中高表達，在正常組織中低表達或不表達。AMG 655與DR5結合后會促使表面高表達DR5的細胞凋亡，其機制主要是通過激活caspase 8通路來實現。Fay F等[22]用人工合成單克隆抗體AMG-655修飾載藥納米粒表層，并用香豆素-6對其進行熒光標記，作用于DR5高表達的結腸癌細胞HCT116，在熒光顯微鏡下觀察，AMG-655-NPs組熒光強度明顯大于被動組，并且強于同型抗體結合的納米粒組，而加入游離的AMG-655之后，熒光強度明顯減弱，說明細胞對納米粒的攝入跟AMG-655與DR5的結合相關。

5 展 望

納米粒經過修飾之后會變得更智能，近年來有眾多學者將不同的主動靶向修飾方法相結合，大大改善了納米粒的靶向性，尤其治療與診斷相結合的納米粒讓腫瘤治療邁進了新的時代。納米粒的實驗室制備技術已經發展的相當成熟，但是仍然還有許多問題亟待解決，比如正常組織中也存在靶點受體，會對正常組織產生損傷；配體的偶聯度不能達到靶向要求等。目前納米粒大多處于臨床前研究階段，因此，如何將抗腫瘤納米粒推向臨床是一個迫切而又慎重的問題。

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