色譜-質譜聯用法在體液小分子檢測中的應用

王少敏 張凱 楊貫羽

(鄭州大學化學與分子工程學院 河南鄭州 450052)

近年來，隨著聯用技術的不斷革新，色譜-質譜聯用技術在體液小分子分析中發揮了越來越重要的作用。色譜的優勢在于分離，可將復雜混合物中的各組分分離，但定性和確定物質結構的能力較差；質譜能夠提供物質的結構信息，但樣品需要純化后才能進樣分析。接口技術將這兩種分析方法結合起來，協同作用，取長補短，使色譜-質譜聯用法在生物樣品分離分析中備受青睞，已廣泛應用于體液小分子的檢測[1]。

體液即身體內的液體，主要包括尿液、血液、唾液、羊水、人奶、精液、腦脊髓、肺腔的液體等。體液中除了水還含有豐富的化合物。體液小分子通常是指相對分子質量小于1000的物質，主要有核苷、氨基酸、糖類和其他一些代表性化合物。這些物質在體液中的種類和含量反映了機體的代謝狀況，而利用色譜-質譜聯用技術檢測體液小分子所得到的一系列樣品信息，對研究人類機體代謝有著積極的指導意義。色譜-質譜聯用技術主要包括氣相色譜-質譜聯用、液相色譜-質譜聯用和毛細管電泳-質譜聯用。這些聯用技術憑借各自的優勢為分離分析體液小分子提供了廣闊的平臺。

1 氣相色譜-質譜聯用法(GC-MS)

GC-MS是分析儀器中最早實現聯用技術的儀器。GC主要是利用物質的沸點、極性及吸附性質的差異來實現混合物的分離。樣品進入氣化室氣化后，被載氣帶入色譜柱，載氣的流動使樣品組分在運動中進行反復多次的分配，最終載氣中分配濃度大的組分先流出，固定相中分配濃度大的組分后流出。經氣相色譜柱分離后的樣品呈氣態，并且流動相也是氣體，與質譜的進樣要求相匹配，可直接引入質譜，而質譜又具有高靈敏度、高鑒別力的特點，因此GC-MS是分析復雜混合物最為有效的手段之一。對于極性強、揮發性低的物質，需要衍生化后再進行GC-MS分析，在改善分析對象的揮發性同時還能提高檢測靈敏度。例如梅慧芬等[2]在利用GC-MS技術對半乳糖血癥患兒尿液成分的分析中檢測到至少34種代謝物。

體液的種類繁多，但目前用于實驗研究的主要是尿液和血液，這是由于這兩種類型的體液來源廣泛，采樣方便并且可以連續性取樣。而尿液以其非侵入性無損取樣的優勢，應用最為廣泛。因此，我們的綜述內容也主要集中于色譜-質譜技術在尿液和血液中的小分子檢測。

1.1 GC-MS法檢測尿液中小分子

人的尿液中包含上萬種化合物，這些化合物代表了人體的代謝狀況。準確分離分析尿液中的小分子化合物，能為各種疾病的診療提供可能的依據。例如，Nasrallah F等[3]利用GC-MS法分析了肌酸缺乏癥(CDS)患者尿液中胍基乙酸和肌酸的含量，并將實驗結果與HPLC-MSMS法比較，最終認定該法對于診斷CDS是一種快速、可靠、可行的方法。

肝癌是一種常見的惡性腫瘤，Wu H等[4]處理了20位男性肝癌患者和20位男性正常人的尿樣，經衍生化后通過GC-MS檢測，發現了103種代謝產物，其中66種是已經標記過的已知物質，18種代謝產物在肝癌患者和正常人中有顯著性差異——這種以尿樣代謝物作為生物標志物的非侵入性技術具有重要的臨床意義；朱鳳英等[5]研究發現4-庚酮和二甲硫醚的含量與膀胱癌具有相關性。推測二甲硫醚可能來源于含硫化合物在人體內的合成降解，而4-庚酮可能來源于增塑劑鄰苯二甲酸二異辛脂在人體內的降解；胃癌是消化道常見的惡性腫瘤之一，目前主要依靠胃鏡、病理、血清學等技術確診，但這些手段有些敏感性不足，有些有一定創傷。張東兵等[6]比較了胃癌患者術前、術后尿液和健康人尿液的分析結果，發現患者尿液中天冬氨酸、賴氨酸、2-甲基-3-氧-丁酸乙酯含量升高，對胃癌的診斷具有潛在臨床價值。

在生物遺傳的研究中，8-羥基脫氧鳥苷在DNA的復制和修復過程中誘發DNA點突變，被公認為是DNA氧化損傷的一種主要的標記物。研究發現癌癥患者尿液中的8-羥基脫氧鳥苷含量明顯高于正常人，這在醫學上有著重要的應用價值。梅素榮等[7]利用GC-MS測定了尿液中8-羥基脫氧鳥苷的含量，驗證了GC-MS法的實用性，為癌癥患者的診療提供了一種新的可能手段。

Kochnova E A等[8]以GC-MS技術分析了運動員尿液中的甾體化合物，共定量檢測出36種內源性甾體化合物。

隨著科學家對人類基因和遺傳代謝研究的深入以及各種實驗分析技術的發展，越來越多的遺傳代謝病被檢測和識別。韓連書等[9]應用串聯質譜和GC-MS法檢測了氨基酸代謝病、有機酸血癥和脂肪酸β氧化代謝病等一系列遺傳性代謝病患者的尿液，發現兩種技術結合，能夠同時檢測出30余種遺傳代謝病。

1.2 GC-MS法檢測血液中小分子

人體各器官的生理和病理變化，往往會引起血液成分的改變，通過分析血液成分可以了解人體狀況。例如血清葡萄糖的含量是人體健康狀況的重要指標，能為糖尿病、高血壓以及心腦血管等疾病的診療和防控提供有效依據。丁兆婷等[10]運用同位素稀釋質譜法配制了一系列溶液，并向血清樣品中加入內標，利用GC-MS法測定血糖含量，大大減低了測量結果的不確定度，完善了血糖含量檢測的參考系統。

酒后駕車是非常嚴重的交通安全問題，乙醇在體內代謝很快，一般酒后幾小時體內就檢測不到乙醇成分，但是一部分乙醇進入體內會與尿嘧啶核苷-5′-二磷-葡萄糖醛酸結合形成乙基葡萄糖醛酸苷，如果事故時間間隔過長，血液中乙醇成分無法檢測，卻可以通過檢測乙基葡萄糖醛酸苷的含量來解決問題。運用GC-MSMS聯用方法檢測血液中乙基葡萄糖醛酸苷，簡單、快速，適合于檢驗案例[11]。

Kawana S等[12]建立了一種簡單快速分析血樣中氨基酸的GC-MS方法，其中包括纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸和苯丙氨酸等，血樣經過處理衍生化后，實驗回收率為69.8%～87.9%，每個樣品的分析時間為26分鐘，這幾種物質的檢測限依次為24.2、16.7、8.7、1.5和12.9μmol/L。

1.3 GC-MS法檢測羊水中小分子

有機酸是氨基酸、脂肪、糖類中間代謝過程中產生的羧基酸，但是由于某種酶缺陷會導致這些酸代謝異常在體內累積，因此檢測體液有機酸含量可以作為疾病診療的一種手段。丁一峰[13]利用GC-MS分析了63例正常羊水，共檢測出131種有機酸代謝物，并計算出代謝物濃度，提供了代謝物參考值，為今后遺傳代謝病的羊水產前診斷提供了方法和依據；方法具有檢測時間短，避免母源性污染的特點。

1.4 GC-MS法檢測唾液中小分子

GC-MS法在檢測唾液中化合物也有一定應用。例如Janowska E等[14]將唾液酶解、脫蛋白、固相萃取、衍生化，選取D3-嗎啡和D3-可待因作為內標，利用GC-MS法檢測唾液中嗎啡和可待因的含量。嗎啡和可待因的檢測限分別是4ng/mL和5ng/mL，定量限依次為14ng/mL和15ng/mL，定量范圍20～1000ng/mL，回收率為50%～60%。為了檢驗方法的實用性，隨機抽取10位吸毒者的唾液驗證，結果表明該方法適用于追蹤戒毒過程。

2 液相色譜-質譜聯用法(LC-MS)

ESI源的出現使LC-MS技術飛速發展。LC-MS法的基本原理是依靠分析物質在固定相和流動相中分配系數的差異，經過色譜柱將物質分離，陸續進入質譜檢測。LC-MS除了能夠分析GC-MS法不能分析的強極性、難揮發、熱不穩定性的化合物外，還具有分離能力強、定性分析可靠、檢測限低等優點，因此在體液小分子的檢測中具有更廣泛的應用。

2.1 LC-MS法檢測尿液中小分子

尿液中的修飾核苷是機體RNA的代謝產物，由于不能被機體再利用而通過尿液排出體外，因此尿液修飾核苷的含量能夠反映機體細胞RNA的代謝速率以及細胞增殖狀況。依托LC-MS法檢測尿液中修飾核苷的研究，完善了腫瘤標志物的種類，增強了疾病檢測的手段。例如，Jeng L B等[15]利用LC-MS技術對25位肝癌患者和20位健康人的尿液核苷進行了分析，結果發現肝癌患者尿液中的腺苷、胞苷和次黃苷的平均含量明顯高于正常人，認為這3種核苷可以作為潛在的腫瘤標志物用于肝癌的診斷。大連化物所許國旺課題組分別以HILIC和RPLC分離法，利用UPLC-MS技術分析了肝癌患者和正常人尿液成分，結果發現HILIC比RPLC具有更高的靈敏度和穩定性[16]。此外，他們在對結腸癌研究中加入良性結腸腫瘤對照，通過UPLC-MS和SPE-HPLC對34位正常人、34位良性腫瘤(BCT)患者和50位結腸癌(CRC)患者的尿液進行了分析，結果發現苯乙酸谷氨酸有加快細胞凋亡、控制細胞增殖和調節致癌基因表達的作用，在CRC中含量最高，其含量的升高能夠反映癌癥的轉變。在尿液核苷的檢測中，2,2-二甲基鳥苷和N6-甲基腺苷在CRC和BCT中含量較高，但兩者沒有明顯差異；而假尿苷、胞苷、尿苷和1-甲基腺苷在CRC中含量高。研究結果表明，腫瘤細胞的核苷代謝比正常人復雜，腫瘤細胞具有更高的代謝能力[17]。

單一的方法可能會使極重要的潛在生物標志物缺失，中國醫學科學院/北京協和醫學院再帕爾·阿不力孜課題組[18]選用不同離子源模式如(±)ESI-MS、(±)APCI-MS、(±)APPI-MS檢測肺癌患者尿液。有11種物質被識別，包括5種氨基酸、5種核苷和1種吲哚代謝物，為研究肺癌代謝組學提供了有力的依據。此外，他們[19]利用RRLC-MSMS法，在數據分析中創新性地引入偏相關分析方法構建相關性網絡，結合多變量分析方法共同尋找可能的生物標記物，在乳腺癌患者尿液的檢測中識別出涉及氨基酸、有機酸和核苷的12種潛在腫瘤標志物。

此外，Hsu W Y等[20]利用LC-MS技術分析尿液核苷來尋求更加靈敏和精確的大腸癌標記物。Lee S H等[21]對老年癡呆癥病人的尿液檢測中發現3-甲基尿苷、1-甲基腺苷、8-羥基-2′-脫氧鳥苷、2-脫氧鳥苷、假尿苷和N2,N2-二甲基鳥苷等6種核苷含量比正常人顯著增高。我們也利用LC-MS法在淋巴癌患者尿液提取物中鑒定出26種核苷，其中包括3-甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、5′-脫氫-2′-脫氧次黃苷、3-甲基鳥嘌呤、O6-甲基鳥苷和7-甲基-1-乙基鳥苷6種未見報道的核苷[22]。

尿液激素類化合物的檢測也是研究熱點之一。在類固醇類激素的研究中，王萌燁等[23]采用LC-MSMS方法，建立起測定尿液中睪酮、表睪酮、脫氫表雄酮、雄酮和苯膽烷醇酮等5種激素的方法替代GC-MS法用于日常分析工作。

2.2 LC-MS法檢測血液中小分子

系統性紅斑狼瘡(SLE)是一種涉及多個系統和臟器的自身免疫性疾病，我國的SLE的患病率高于西方國家。俞穎等[24]應用LC-MS技術對SLE患者血漿樣本進行了代謝指紋圖譜分析，定性鑒定出7種代謝標志物，發現患者的氨基酸、磷脂和卟啉代謝異常，完善了該病的診斷依據。

血液中的激素也可以利用LC-MS法檢測。孕酮對妊娠婦女維持正常的妊娠過程起重要作用。張超等[25]建立了測定血液中孕酮含量的LC-APCI-MSMS聯用方法：線性范圍0.2～50ng/mL，最低定量限為0.2ng/mL，靈敏度高、檢出限低。初陽等[26]同樣利用HPLC-MSMS聯用技術建立了測定人血清內源性激素睪酮含量的方法。

在對血漿氨基酸的檢測中，趙華等[27]利用LC-MS技術檢測了血漿中的異亮氨酸異構體，并測定了血漿中異亮氨酸異構體的含量。血漿氨基酸代謝譜與糖尿病有相關性，韓曉菲等[28]采用鄰苯二甲醛柱前在線衍生反相HPLC法建立了血漿中21種氨基酸代謝譜的相對定量方法，通過比較糖尿病患者與志愿者的氨基酸代謝發現，有7種氨基酸承載了分組的重要信息，可作為反映血糖值高低變化的標志物組，對于糖尿病的早期診斷及深入研究具有潛在的科研及臨床價值。

2.3 LC-MS法檢測唾液中小分子

唾液中物質的檢測主要應用于藥物的服用檢測。例如，Coulter C等[29]利用LC-MSMS分析唾液中的一種新的鎮疼藥tapentadol及其代謝產物N-desmethyltapentadol (DMT)，檢測線性范圍是10～100ng/mL，最低定量限是10ng/mL，兩者回收率均大于99%。雖然LC-MS技術能夠檢測80%有機化合物，但其自身也有不足，還需要不斷完善。

3 毛細管電泳-質譜聯用法(CE-MS)

CE是近年發展迅速的一種分離分析方法，其基本原理是電泳和色譜，是一類以毛細管為分離通道、以高壓直流電場為驅動力的新型液相分離分析技術。CE-MS與LC-MS的應用在方法學和分析對象上有許多相似之處。例如都適用于小分子和大分子的分析，適用于熱不穩定、強極性分子乃至離子型化合物的分離分析，具有分離效率高、分析速度快、樣品適應面寬、試劑盒樣品消耗量少、分離模式多等特點。它的高度分離能力與質譜的強鑒定能力聯用在一起，是一種理想的完美結合。例如，Johannesson N等[30]建立了用于闌尾炎病人血樣中生物標記物篩選的CE-MS方法，發現病人治療前后的血樣有差異，兩種不同類型的闌尾炎也有差異。Mayboroda O A等[31]利用CE-TOF-MS技術分析尿樣中的氨基酸，通過調節pH可使大多數氨基酸檢出限低于50nmol，并成功分析了關節炎病人尿樣。浙江大學程翼宇課題組[32]利用CE-MS法分析了20位膀胱癌患者和20位正常人患者尿液，檢測到m/z317、290、304可以作為潛在的生物標志物。

4 結語

人類探尋自身奧秘的過程是一部科技發展史。色譜-質譜聯用法的發展推動了體液小分子檢測的進程，目前的聯用方法實現了對生物樣品快速準確的分析，具有高通量、高靈敏度的特點。GC-MS相比LC-MS來說具有通用型檢測器，并且具有豐富的譜圖檢索庫，使得物質的定性分析快速方便準確，但由于其對樣品揮發性的限制，不能直接分析難揮發的有機化合物。GC-MS直接導入型接口的載氣限于氦氣和氫氣，當從色譜柱出口進入質譜離子源的載氣流量高于2mL/min時，離子源的真空度會下降。因此，GC-MS在簡化樣品預處理過程，改進衍生化方法等方面仍有改進的空間。

對于LC-MS來說，儀器昂貴，使用有機溶劑作為流動相，分析成本高于GC；當采用含不揮發性鹽的流動相時，質譜的靈敏度會下降，且離子源會被污染；此外，LC不能分析常規氣體；LC-MS目前還沒有像GC-MS那樣的通用譜庫。這些都影響了LC-MS作為常規方法的應用。

CE-MS技術的發展尚不完善，在分析重現性和靈敏度等方面仍需不斷改進。除了不能使用不揮發性鹽以外，無鞘流電噴霧接口的穩定性還較差。不斷改進接口技術，CE-MS技術會在藥物分析、臨床醫學、單細胞分析尤其是蛋白質組學等熱門領域發揮更全面、更強大的作用。可以預見，隨著科學技術的不斷成熟，聯用法在體液小分子檢測乃至其他領域的應用將越來越廣闊，具有巨大的發展空間。

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