廣林9號桉葉多酚抗氧化活性研究

王俊亮，肖蘇堯，陳運嬌，陳雪香，湯 杰，曹 庸

(華南農業大學食品學院，廣東 廣州 510642)

廣林9號桉葉多酚抗氧化活性研究

王俊亮，肖蘇堯，陳運嬌，陳雪香，湯 杰，曹 庸*

(華南農業大學食品學院，廣東 廣州 510642)

采用不同極性有機溶劑對廣林9號桉葉提取物進行系統萃取分離，用福林-酚法測定各組分的總酚含量，以1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2＇-聯氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、還原能力3種體外抗氧化活性方法測定了桉葉各組分的抗氧化活性。結果表明，不同萃取組分中，乙酸乙酯組分總酚含量最高，達到502.67mg/g；其對DPPH自由基和ABTS＋·的清除能力和還原能力也最強，優于陽性對照物茶多酚，其清除兩種自由基的IC50分別為0.097mg/mL 和0.034mg/mL；通過總酚含量與抗氧化活性比較發現，其抗氧化活性與總酚含量成正相關，由此判斷桉葉提取物的抗氧化活性成分主要為多酚類物質；桉葉粗提物中多酚含量達到30%以上，與茶葉粗提物中多酚含量相當，具有開發意義。

桉葉；多酚；抗氧化能力；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)；2,2＇-聯氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸) (ABTS)

桉樹是桃金娘科桉屬(Eucalyptus)植物的通稱，具有生長快、適應自然環境能力強、抗病蟲害、經濟價值高等特點，是世界三大速生樹種之一[1-2]。我國近年來在華南、廣西等地大面積種植桉樹，桉樹已經成為中國造紙業和林業中的生力軍，而同時產生大量桉葉，桉葉除部分用于提取桉葉油以外，多數未加利用，綜合利用度很低。現代研究表明，桉葉中除含有揮發性芳香油以外，還含有大量黃酮類化合物、酰基間苯三酚衍生物、非揮發性萜類及其苷類、鞣質等活性物質[3]，因此系統地對桉葉中活性物質進行研究，并加以開發應用，可以極大地提高桉樹的經濟價值。有研究表明，已從藍桉中分離出抗氧化活性較強的多種多酚物質[4-6]，本實驗室的前期工作表明，桉葉粗提物多酚含量達到30%左右，與茶葉粗提物多酚含量相當，且抗氧化活性強[7]。因此本研究在前期工作的基礎上，對桉葉粗提物進行系統的分離，利用福林-酚比色法[8-9]對多酚含量進行分析，并通過抗氧化活性檢測進行活性跟蹤。

目前，天然產物的抗氧化能力檢測方法主要有化學測定法和細胞評價方法，其中化學測定方法有以脂質過氧化為基礎的測定方法、清除自由基為基礎的測定方法、對抗氧化酶活性的影響、DNA氧化損傷的測定等方法，由于天然抗氧化物種成分復雜，抗氧化作用機制無法用單一機制解釋，因此常常需要用兩種或兩種以上抗氧化活性評價方法[10]。對于天然抗氧化劑的初步篩選，基于清除自由基基礎的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)法、2,2＇-聯氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸) (ABTS)法與其他抗氧化方法相比操作簡單、快速、穩定，不需要特殊的檢測設備，這兩種方法都是基于分光光度法來測定樣品的抗氧化活性，在國內外有著廣泛的應用。而鐵離子還原能力可以間接表明樣品抗氧化能力，操作簡單、穩定。因此，本實驗主要采用DPPH法、ABTS法和鐵離子還原能力法對桉葉不同萃取組分進行體外抗氧化活性檢測，以期為桉葉抗氧化活性物的篩選及綜合開發桉樹葉資源提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

廣林9號桉葉，2009年9月采于湛江，自然晾干，粉碎后取40～60目進行實驗。

乙醇、石油醚、氯仿、正丁醇、乙酸乙酯、VC、過硫酸鉀、福林-酚試劑、三氯乙酸、鐵氰化鉀、Na2CO3、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉均為分析純；50%多酚含量的茶多酚 潮州翼龍有限公司；DPPH、ABTS美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

U-3010紫外-可見分光光度計 日本日立公司；R204旋轉蒸發器 上海申生科技有限公司； KQ-500B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司； FD-1PF冷凍干燥機 北京德天佑科技發展有限公司、MK-3酶標儀美國Thermo Labsystems 公司。

1.3 方法

1.3.1 桉葉成分的提取分離

桉葉粗提物的制備[7]：稱取桉葉粉末100.0g，加入20倍體積的70%乙醇溶劑，超聲波提取兩次，每次30min，減壓抽濾，合并濾液，減壓旋轉蒸發溶劑后，用蒸餾水定容到100mL。

粗提物的系統萃取分離：對上述粗提物依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇等不同極性溶劑進行萃取，萃取物用減壓旋轉蒸發后冷凍干燥，冷藏備用。

1.3.2 多酚含量的測定(福林-酚比色法)[8-9]

標準曲線的繪制：準確稱取真空干燥至質量恒定的沒食子酸標準品44.3mg，用水溶解并定容100mL。以此溶液配成質量濃度8.86、17.72、35.44、52.16、70.88、88.60μg/mL的溶液。分別取上述不同質量濃度溶液1mL加到10mL比色管中，然后依次加入1mL去離子水，0.5mL已稀釋2倍的福林-酚試劑，1.5mL 26.7g/100mL的Na2CO3溶液，最后用水定容至10mL，室溫反應2h，用分光光度計測定其在760nm波長處的吸光度。由吸光度對質量濃度進行回歸，求得標準曲線。

試樣測定：準確稱取適量試樣，用水溶解，質量濃度在0.1mg/mL左右。取1mL樣品加到10mL比色管中，依次加入去離子水1mL、福林-酚試劑0.5mL、26.7g/100mL Na2CO3溶液1.5mL，然后用水定容至10mL，室溫反應2h，用分光光度計測定其在760nm波長處的吸光度。測定的吸光度代入標準曲線，求得試樣中總多酚的含量，以沒食子酸含量計。

1.3.3 清除DPPH自由基能力的測定[10-11]

分別將各相萃取物用甲醇配成0.02、0.05、0.08、0.11、0.14、0.17、0.20mg/mL系列梯度樣品質量濃度，取上述配好樣品0.2mL 及1 × 10-4mol/L DPPH溶液3.8mL加入同一具塞試管中搖勻，在室溫密閉靜置30min，用純溶劑作參比，用分光光度計測定其在517nm波長處的吸光度。根據公式(1)計算每種樣品對DPPH自由基的清除率。

式中：As為加0.2mL樣品液后DPPH溶液的吸光度；Asb為0.2mL樣品液＋3.8mL溶劑(甲醇)后的吸光度； Ac為0.2mL溶劑(甲醇)＋3.8mL DPPH溶液的吸光度。

以上述方法測定其清除率，根據回歸分析求出清除率達到50%時的樣品質量濃度即IC50。

1.3.4 清除ABTS＋·能力測定[12-14]

將5mL的7mmol/L ABTS和88μL的140mmol/L過硫酸鉀混合，在室溫、避光的條件下靜置過夜(12～16h)，形成ABTS儲備液，使用前用10mmol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋成工作液，使其在室溫下于條件734nm波長處的吸光度為0.70±0.02。分別將各相萃取物用甲醇配成0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07mg/mL系列梯度樣品質量濃度，測定時在96孔微量滴定板的每孔中加入200μL的ABTS工作液，再加入10μL的樣品，以200μL ABTS工作液＋10μL溶劑為空白，混合10s，于6min后讀取405nm波長處的吸光度A，根據式(2)計算每種樣品對ABTS＋·的清除率。

式中：A1為200μL ABTS工作液＋10μL樣品液后的吸光度；A0為200μL ABTS工作液＋10μL甲醇后的吸光度。

1.3.5 還原能力測定[15-16]

在2.5mL pH6.6的磷酸鹽緩沖液中加入用甲醇配成0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14mg/mL系列梯度質量濃度的不同桉葉萃取物樣液2.5mL、1%的鐵氰化鉀溶液2.5mL，混合物在50℃恒溫20min后，再加入2.5mL 10%的三氯乙酸溶液，然后以3000r/min離心分離10min，取上層清液5mL加蒸餾水5mL和0.1% FeCl3溶液lmL，在波長700nm處測定吸光度，吸光度越高，還原能力越強。

2 結果與分析

2.1 桉葉不同萃取物總酚含量測定結果

以沒食子酸質量濃度(μg/mL)為橫坐標，吸光度為縱坐標，得回歸方程：y＝0.0096χ＋0.0271(R2＝0.9981)。樣品中總酚的含量在標準曲線中查出相應的值，總酚含量以沒食子酸的相對量表示。

從表1可見，桉葉提取物不同溶劑萃取物中，乙酸乙酯總酚含量最大，其次為正丁醇、水相，而石油醚相、氯仿相總酚含量較小，不同溶劑系統萃取分離對桉葉多酚能夠起到一定的分離效果，從桉葉粗提取物多酚含量可以看出，其多酚含量達到30%以上，與茶葉粗提物中茶多酚含量相當，桉葉原料豐富，因此大量開發桉葉多酚將具有十分重要意義。

2.2 桉葉不同萃取物清除DPPH自由基能力

圖1 桉葉不同萃取物清除DPPH自由基能力Fig.1 DPPH radical scavenging activity of the crude ethanol extract and its fractions

如圖1所示，同一樣品隨著樣品質量濃度增大，其清除DPPH自由基能力逐漸增大，且VC質量濃度在達到0.11mg/mL后，其清除率趨于平緩，達到最大。而乙酸乙酯萃取物在質量濃度達到0.17mg/mL時，其清除率接近VC，且達到最大。由此可見，桉葉不同萃取物中，乙酸乙酯萃取物清除DPPH自由基能力最強，且清除能力大于茶多酚，與VC接近。通過SPSS軟件回歸分析，得出其IC50為0.097mg/mL，可信區間為0.077～0.111mg/mL。

2.3 桉葉不同萃取物清除ABTS＋·能力

圖2 桉葉不同萃取物清除ABTS＋·能力Fig.2 ABTS radical scavenging activity of the crude ethanol extract and its fractions

如圖2所示，同一樣品隨著樣品質量濃度增大，其清除ABTS＋·能力逐漸增大，而乙酸乙酯萃取物在質量濃度達到0.05mg/mL時，其清除率趨于平緩，且達到最大值。桉葉不同萃取物中，乙酸乙酯萃取物清除ABTS＋·能力最強，且清除能力大于茶多酚和VC。通過SPSS軟件回歸分析，得出其IC50為0.034mg/mL，95%可信區間為0.029～0.037mg/mL。

2.4 桉葉不同萃取物還原能力

圖3 桉葉不同萃取物對鐵離子的還原能力曲線Fig.3 Ferric ion reducing power of the crude ethanol extract and its fractions

表1 桉葉不同萃取物總酚含量Table1 Total phenloic contents of the crude ethanol extract and its fractions

表2 桉葉不同萃取物對DPPH自由基、ABTS＋·的IC50值Table2 IC50values of the crude ethanol extract and its fractions against DPPH and ABTS radicals

由圖3可知，同一樣品隨著樣品質量濃度越大，其吸光度越大，即還原能力越強，且VC在質量濃度達到0.08mg/mL后，其吸光度趨于平緩，即還原能力達到最大；桉葉不同萃取物中，乙酸乙酯萃取物還原能力最強，其還原能力大于茶多酚，最接近VC；VC在反應體系中吸光度較大，可能是VC在此體系中較易提供電子。

2.5 桉葉不同萃取物清除DPPH自由基、ABTS＋·能力比較

桉葉萃取物不同質量濃度條件下對DPPH自由基體系，ABTS＋·體系的清除作用有所不同，同一萃取物在一定的質量濃度范圍內，樣品質量濃度越高，其清除率越高，抗氧化活性越強。通過SPSS軟件算出桉葉不同萃取物對兩種自由基清除能力的值見表2。桉葉不同萃取物中，乙酸乙酯萃取物清除DPPH自由基和ABTS＋·的IC50最小，即抗氧化活性最強；由于反應體系不同，其對兩種自由基清除能力也有所不同，但兩種方法具有很好的相關性。桉葉石油醚萃取物和氯仿萃取物清除DPPH自由基和ABTS＋·的IC50的95%可信區間較大，可能是因為這兩個組分在所做樣品質量濃度范圍內清除率較小，所求IC50誤差就較大，95%可信區間大。

2.6 桉葉不同萃取物多酚含量與其抗氧化能力分析

為比較桉葉不同萃取物抗氧化能力與其總酚含量關系，以桉葉不同萃取物清除DPPH自由基和ABTS＋·的IC50的倒數與其總酚含量為縱坐標作圖，IC50倒數值越大，其抗氧化能力越強。抗氧化能力與其多酚含量關系見圖4。總酚含量越多，抗氧化能力越強，其抗氧化能力與其總酚含量成正相關，因此可以判斷桉葉中起抗氧化作用的物質為多酚類物質。且桉葉不同萃取物抗氧化能力強弱為：乙酸乙酯萃取物＞正丁醇萃取物＞水萃取物＞石油醚萃取物＞氯仿萃取物。抗氧化強的組分主要存在于中等極性和極性大的組分中，這也與多酚的性質相關。石油醚萃取物主要是極性小的脂溶性物質，氯仿萃取物主要是糖類和蛋白，多酚含量少，因此抗氧化活性也低。

圖4 桉葉不同萃取組分抗氧化活性與其總酚含量關系Fig.4 Positive correlation between total phenolic content and antioxidant activity for the crude ethanol extract and its fractions

3 結論與討論

本實驗結合總酚含量和抗氧化活性評價對桉葉抗氧化物進行系統研究，研究表明桉葉中含有大量多酚，粗提取物中多酚含量達到30%以上，與茶葉粗提取物中多酚含量相當，通過體外抗氧化活性測定表明，其抗氧化活性與其總酚含量成正相關，初步的系統萃取分離對桉葉抗氧化物有較好的分離效果，且得到總酚含量最高，抗氧化活性最強的乙酸乙酯組分，其抗氧化活性較50%多酚含量的茶多酚強，與VC接近，因此桉葉多酚具有很高的開發價值；DPPH法、ABTS法和鐵離子還原法對桉葉抗氧化物體外抗氧化活性評價有較好的相關性，3種方法在一定質量濃度范圍內都隨樣品質量濃度增大，抗氧化活性增強，DPPH法、ABTS法對于桉葉抗氧化活性的評價快速、穩定、準確，因此可以將其作為桉葉抗氧化物活性評價及抗氧化活性物質篩選的評價方法。

桉葉資源豐富、總酚含量高、抗氧化活性強，如果能用DPPH法、ABTS法這兩種活性評價方法對桉葉乙酸乙酯組分進行活性跟蹤分離純化，分離出其抗氧化活性物質，確定其起抗氧化活性的物質基礎，開發食品抗氧化劑或者抗氧化保健品，對于桉葉的綜合利用將具有十分重要的意義。

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Antioxidant Activity of Polyphenol Extracts from Leaves of E. grandis×E. urophylla Guanglin No. 9

WANG Jun-liang，XIAO Su-yao，CHEN Yun-jiao，CHEN Xue-xiang，TANG Jie，CAO Yong*
(College of Food Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

Crude ethanol extract from the leaves of E. grandis×E. urophylla Guanglin No. 9 was fractionated by repeated extractions sequentially with solvents of different polarity into petroleum ether-soluble, chloroform-soluble, ethyl acetatesoluble, n-butanol-soluble fractions and residue. Total phenolic contents in the six samples were determined by Folin-Ciocalteu method. Meanwhile, their antioxidant activity was tested by in vitro ABTS, DPPH and FRAP assays. The results indicated that among the samples, the ethyl acetate-soluble fraction showed the highest total phenolic content, 502.67 mg/g, and the strongest ABTS and DPPH scavenging activity and reducing power activity, which were better than those of VC. The IC50 values of the fraction against DPPH and ABTS radicals were 0.097 mg/mL and 0.034 mg/mL, respectively. Moreover, a positive correlation between total phenolic content and antioxidant activity was observed for all the samples. This indicates that polypehnolics are mainly responsible for their antioxidant activity. The crude ethanol extract exhibited a total phenloic content (over 30%) similar to that of its counterpart from tea. This study demonstrates that the crude ethanol extract has a high exploitation potential.

eucalyptus leaf；polyphenol；antioxidant activity；DPPH；ABTS

Q946

A

1002-6630(2012)01-0020-05

2011-02-18

國家林業公益性行業科研專項(201104003-03)

王俊亮(1984—)，男，碩士研究生，研究方向為食品化學與營養。E-mail：wjl3333@163.com

*通信作者：曹庸(1966—)，男，教授，博士，研究方向為天然產物與功能性食品開發。E-mail：caoyong2181@scau.edu.cn