藻藍蛋白酶解肽的分離純化及其細胞毒活性

王雪青，鄧 偉，楊進芳，毛羽聰，史中明

(天津市食品與生物技術重點實驗室，天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津 300134)

藻藍蛋白酶解肽的分離純化及其細胞毒活性

王雪青，鄧 偉，楊進芳，毛羽聰，史中明

(天津市食品與生物技術重點實驗室，天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津 300134)

研究鈍頂螺旋藻(Spirulina platensis)藻藍蛋白(C-phycocyanin，C-PC)及其胰蛋白酶水解肽的分離純化。采用反復凍融和超聲破碎法破碎細胞，用28～55g/100mL硫酸銨沉淀反復鹽析獲得純度(A620nm/A280nm)為2.19的藻藍蛋白，再通過羥基磷灰石(HA)柱層析和Sephacryl S-200 HR凝膠層析對其進行純化，得到純度(A620nm/A280nm)為3.89藻藍蛋白。純化后的藻藍蛋白在40℃條件下經胰蛋白酶酶解60min后，用DEAE-Sepharose Fast Flow柱層析對酶解肽產物進行分離，收集得到4組藻藍蛋白酶解肽。采用MTT方法，研究藻藍蛋白、酶解混合液、分離的4個酶解肽組分對腫瘤細胞系HeLa和293T增殖的影響。結果顯示：肽組分1和4對HeLa細胞的抑制率分別為37.71%和47.04%，而混合肽和藻藍蛋白抑制率分別為34.02%和26.03%，因此活性肽組分1和4顯示出較好的腫瘤抑制效果，而這兩種活性肽組分對正常細胞293T并無細胞毒活性，特別是組分4效果最明顯，是極具開發潛力的保健產品。

藻藍蛋白；純化；酶解肽；細胞毒活性

藻藍蛋白(C-phycocyanin，C-PC)是從螺旋藻等藻體中提取的一種光合輔助色素蛋白，無毒呈藍色。許多研究報道，C-PC具有抗腫瘤[1-5]、抗輻射[6]、免疫調節[7]和保護神經[5,8]等生理作用，因此在西方發達國家，已作為添加劑廣泛用于功能性食品和高級化妝品中。按照C-PC在特定波長吸光度的比(A620nm/A280nm)大小，將其分為食品級(A620nm/A280nm≥0.5)、化妝品級(A620nm/A280nm≥2.0)和試劑級(A620nm/A280nm≥4.5)3個級別。不同級別的C-PC，價格和用途也不相同。高純度的C-PC可制成熒光探針，已在臨床診斷和生物分析檢測領域中顯示出良好的應用開發前景。但由于C-PC提取純化工藝相對復雜且成本較高，加之其穩定性較差，許多環境因素如溫度、光照、pH值和一些食品添加劑均能造成其變性降解[9-10]，限制了C-PC的應用。

一些生物活性肽常以非活性狀態存在于蛋白質中，這些蛋白質經過蛋白酶的水解作用，使隱藏于其中的活性肽釋放出來，有可能發揮出比原有蛋白更多生物活性[11-13]。體內實驗顯示，經口服或灌胃后，C-PC可顯著影響機體的細胞因子網絡，如通過調節輔助性T細胞Th1和Th2細胞因子的表達糾正失衡的Th1/Th2的細胞因子網絡[14]，調節自身免疫平衡狀態和炎癥反應；通過調節細胞集落刺激因子(CSF)[15]、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)及其受體(FGFR-1) 、胰島素樣生長因子(IGF-1)及其受體(GF-1R)的表達，調節維持多種細胞尤其是神經細胞的再生修復[16]；通過明顯下調核轉錄因子NF-κB和白介素IL-6的表達，抑制神經元的凋亡[17]，以此調節免疫功能和炎癥反應，并加強其他細胞因子的效果。由此推測，C-PC可能正是通過腸胃的消化作用，使其內的功能肽段作用的結果。本課題組發現，在特定條件下經胰蛋白酶水解的C-PC得到的酶解產物具有比C-PC本身更高抗腫瘤活性[18]。

本實驗圍繞C-PC的分離純化和純化的C-PC經過酶解處理，柱層析分離，檢測不同組分的抗腫瘤活性進行一系列研究，為C-PC的深加工以及抗癌藥物的開發提供基礎參數。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鈍頂螺旋藻粉 內蒙怡健生物制品有限公司。

羥基磷灰石(HA)粉 四川大學生物材料工程研究中心；細胞株：人宮頸癌細胞HeLa、表達SV40大T抗原的人腎上皮細胞293T取自中科院北京生物制品研究所；丙烯葡聚糖凝膠(Sephacryl S-200 HR)、DEAE瓊脂糖凝膠(DEAE Sepharose Fast Flow)、葡聚糖凝膠(Sephadex G-25) 美國GE公司；DMEM培養基 美國Gibico公司；四甲基噻唑藍(MTT) 中國醫科院血液研究所；胎牛血清(FBS) 蘭州民海生物工程有限公司；胰蛋白酶(Trypsin) 美國Sigma公司；二甲基亞砜(DMSO)天津匯英化學試劑有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

YC-2型低溫層析冷柜 北京長流科學儀器有限公司；CO2培養箱SL型 Shellab公司；高速冷凍離心機美國Sigma公司；酶標儀 美國Thermo Labsystems公司；倒置顯微鏡 北京賽百奧科貿中心；SW-CJ-1F單人雙面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 藻藍蛋白的提取

方案一(傳統的二步鹽析法)：1)細胞破碎：取20g螺旋藻粉溶于400mL的10mmol/L PBS緩沖液中，浸泡4h，于-20～4℃之間反復凍融4次，每次融化后進行超聲破碎，條件為：功率400W，時間6s，間隔15s，60次。4℃、10000r/min離心30min，棄沉淀取上清。2)鹽析：上清液經28g/100mL飽和硫酸銨沉淀，4℃、10000r/min離心30min，取上清。上清液由55g/100mL飽和硫酸銨沉淀，相同條件離心，棄上清。沉淀溶于PBS緩沖液，透析除鹽，得到藻藍蛋白粗提液。

方案二(改進的四步鹽析法)：1)細胞破碎：取40g螺旋藻粉溶于400mL的10mmol/L PBS緩沖液中，過程同方案一。2)鹽析：按照方案一得到的藻藍蛋白粗提液，再按照方案一的操作條件，進行兩次沉淀，兩次離心，得到方案二的藻藍蛋白粗提液。

兩種方案中藻藍蛋白質量濃度與純度的計算：對方案一和方案二上清液中蛋白含量較高的粗提液適量稀釋后，分別測定其上清液在波長620nm和652nm處的吸光度，并按以式(1)計算藻藍蛋白的質量濃度和純度[15]。藻藍蛋白的純度用A620nm/A280nm比值來表示。

式中：ρ為藻藍蛋白的質量濃度/(mg/mL)；A620nm為藻藍蛋白的特征吸光度；A652nm為別藻藍蛋白的特征吸光度。

1.3.2 藻藍蛋白的純化

1.3.2.1 羥基磷灰石柱層析

用5mmol/L pH7.0 PBS緩沖液預平衡層析柱，然后加入粗蛋白提取液上柱，以5～150mmol/L pH7.0的PBS緩沖液加0.1mol/L的NaCl進行濃度梯度洗脫，用紫外檢測儀在波長280nm處獲得吸收峰位置及強度信息，分部收集洗脫液并計算A620nm/A280nm值。獲得的蛋白洗脫液用PEG 20000濃縮。

1.3.2.2 Sephacryl S-200 HR柱層析

用10mmol/L pH7.0 PBS緩沖液預平衡層析柱，經HA柱純化的蛋白液上柱，用0.02mmol/L PBK緩沖液＋0.1mol/L NaCl緩沖液洗脫，于280nm波長處獲得吸收峰位置及強度信息，分部收集洗脫液。取藻藍蛋白部分，經Sephadex G-25脫鹽、凍干，-20℃保存。

1.3.3 藻藍蛋白活性肽的提取

藻藍蛋白酶解肽的制備參照楊瀅瀅[19]的方法。具體操作如下：將純化后的藻藍蛋白配成質量濃度為100μg/mL溶液，用胰蛋白酶進行酶解處理，操作溫度為40℃，pH8.0，酶與底物比1:10，反應時間60min。酶解過程不斷攪拌并控制pH值，以1mmol苯甲基磺酰氟(PMSF)終止反應，凍干。

酶解產物的分離采用DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換柱層析和Sephadex G-25凝膠過濾柱層析。DEAE Sepharose FF柱層析，用緩沖液A：20mmol/L PBS (pH6.8)，緩沖液B：20mmol/L PBS(pH6.8)+1.0mmol/L的NaCl，洗脫程序為：用緩沖液A平衡層析柱，緩慢上樣，用緩沖液A洗脫，待樣品完全流穿，再用緩沖液A與B的梯度洗脫，最后用緩沖液B洗脫。控制流速，于280nm波長處檢測流出液洗脫峰。

經DEAE Sepharose FF分離出的組分蛋白，經濃縮后，Sephadex G-25除鹽，得到的樣品凍干保存。

1.3.4 細胞毒活性實驗

取生長良好的對數期HeLa細胞，制成濃度為1.5× 105個/mL的單細胞懸液，每孔加入100μL于96孔板中培養。實驗設空白：用于調零；陰性對照組：只加 0.01mol/L PBS 10μL；陽性對照組：100μg/mL 5-氟尿嘧啶(5-Fu) 10μL；實驗組：1μg/mL C-PC 10μL，酶解混合多肽和4組分離出的酶解產物10μL，每孔補培養基之總體積100μL。不同處理組加樣48h后棄去上清液，加入5mg/mL MTT，每孔10μL，再補加90μL的PBS以使MTT終質量濃度為0.5mg/mL，37℃繼續培養4h。棄上清液，加入加DMSO 150μL/孔，振蕩混勻后，在酶標儀上測定570nm波長處的吸光度，按式(2)計算藥物對腫瘤細胞生長的抑制率。

2 結果與分析

2.1 不同提取工藝對藻藍蛋白提取效果的影響

利用傳統的二步鹽析法，得到的藻藍蛋白粗提物其純度值(A620nm/A280nm)并不高，僅為1.35，因而要達到純度要求需在后續純化過程中增加操作步驟。本實驗為減輕后期的純化工作，又綜合考慮總操作時間不宜過長，在藻藍蛋白的粗提取過程中利用反復兩次的二步鹽析操作對其進行鹽析提取。提取工藝效果見表1。

表1 不同鹽析工藝對藻藍蛋白提取率和純度的影響Table1 Effect of salting-out on the purity of C-PC

由表1可知，4步鹽析工藝與二步鹽析工藝相比，操作過程中在藻液比提高一倍的基礎上，獲得了藻藍蛋白粗提取產物，且蛋白質提取率相差不大。藻液比相比傳統分離濃度要大，加之硫酸銨飽和溶液會對溶解在其中的蛋白起到保護作用，因此此操作更加適合大量提取。

盡管增加了提取步驟，但這一步驟耗費的過程并不繁瑣，而且藻藍蛋白在硫酸銨溶液中能夠得到保護，并不會因時間過長而產生降解。而粗提過程能夠對藻藍蛋白大量制備，其純度的提高可明顯減少后續純化的工作量，對藻藍蛋白的大規模提取和純化工作有著重要意義。

2.2 藻藍蛋白的純化工藝研究

2.2.1 羥基磷灰石柱層析對藻藍蛋白的分離效果

圖1 藻藍蛋白粗品經羥基磷灰石柱層析洗脫曲線Fig.1 Elution profile of crude C-PC on HA column

粗蛋白經過羥基磷灰石柱層析，磷酸鹽緩沖液梯度洗脫，結果見圖1。經分光光度計檢測A620nm/A280nm，發現目標組分藻藍蛋白主要集中在峰1和峰2。峰3和峰4含有藻藍蛋白和別藻藍蛋白，峰5為別藻藍蛋白。峰1和峰2合并，記為組分I。經檢測，組分I的純度為：A620nm/A280nm＝3.18。

2.2.2 Sephacryl S-200 HR柱凝膠層析對藻藍蛋白的純化

圖2 Sephacryl S-200 HR柱層析洗脫曲線Fig.2 Elution profile of peptide fraction I on Sephacryl S-200 HR gel column

收集峰1和峰2的組分，經過Sephacryl S-200 HR柱凝膠層析得到4個洗脫峰，結果見圖2。峰1呈深藍色，主要成分為藻藍蛋白。收集后經檢測，藻藍蛋白純度為：A620nm/A280nm＝3.89。

目前國內外對藻藍蛋白的柱層析純化制備工藝多為兩種以上不同分離原理的柱層析交替使用，且多為凝膠層析與吸附層析的3步以上交替純化過程才能制備出純度在分析級以上的高純度藻藍蛋白。本研究由于先前粗提過程中已將藻藍蛋白純度提高到了2.19以上，因此在柱層析純化過程中僅使用了兩步過程已使得藻藍蛋白純度達到了3.8以上。

2.2.3 全波長掃描法鑒定純化后的藻藍蛋白

為進一步確定純化出的藻藍蛋白純度，對其進行紫外-可見全波長掃描。由圖3可知，藻藍蛋白在280、360nm和620nm波長處均有特征吸收峰，其最大吸收波長為620nm。再從全波長掃描的數據中分別找出620nm與280nm波長處所對應的截距，得到藻藍蛋白的純度為3.89。

圖3 藻藍蛋白的全波長掃描曲線Fig.3 Full wavelength scanning spectrum of C-PC

2.3 DEAE Sepharose FF柱層析對藻藍蛋白酶解肽的分離純化

圖4 藻藍蛋白酶解多肽的DEAE Sepharose FF柱層析洗脫曲線Fig.4 Elution profile of C-PC hydrolysate on DEAE Sepharose FF column

酶解后的藻藍蛋白多肽混合物經DEAE Sepharose FF柱層析分離，得到洗脫曲線見圖4。綜合波長280nm吸收峰與洗脫時間可判斷，其中，峰1與峰6為洗脫過程中的雜質組分，峰2、3、4、5這4個組分，分別標記為T1、T2、T3、T4。

由于本實驗室前期的研究中，已通過正交法得到了藻藍蛋白功能肽的最佳酶解條件，并且酶解出的藻藍蛋白活性肽的片段分子質量較小，應在5kD以下。因此本實驗在此基礎上采用目前較流行的DEAE Sepharose Fast Flow弱陰離子交換層析對混合多肽產物進行分離。分離出的各組分再通過Sephadex G-25進行凝膠過濾層析純化，同時進行脫鹽，在此過程中，既根據洗脫峰對目標肽組分進行純化，同時又可除去分子質量過小的黃綠色小分子和無機鹽，使分子篩純化與除鹽過程一并進行。

2.4 藻藍蛋白、酶解肽及其各分離組分對HeLa細胞的細胞毒活性

藻藍蛋白、酶解混合肽(標記為TX)、酶解肽組分1～4(標記為T1～T4)及5-Fu(已知的抗癌藥物)作用質量濃度均為100μg/mL，作用時間為30h，研究藻藍蛋白及其活性肽樣品對HeLa細胞和正常細胞293T的作用，并與5-Fu進行比較，實驗結果見表2。

表2 藻藍蛋白、酶解混合肽、酶解肽組分1～4及5-Fu對細胞生長的影響Table2 Effects of C-PC, its hydrolysate, peptide fractions I through IV and 5-Fu on cell growth

從表2可知，在質量濃度達到100μg/mL時，酶解肽組分1、2、3、4對HeLa細胞的抑制率分別達到37.71%、24.08%、27.88%和47.04%，混合酶解肽的抑制率34.02%，藻藍蛋白的抑制率為26.03%，5-Fu抑制率為54.92%。分離后的酶解肽組分1和組分4的抑制率均高于混合酶解肽，尤其是組分4顯著比混和酶解肽與藻藍蛋白的抑制率要高，接近于陽性對照組。而相同濃度下的酶解肽分離組分、混合肽、藻藍蛋白均對正常細胞293T的生長沒有表現出任何抑制作用，反而有微弱的促進作用，促進增殖率從18.02%到28.67%不等，實驗結果反映出藻藍蛋白及其酶解肽對正常細胞沒有抑制活性。而抗腫瘤藥物5-Fu會抑制293T細胞的生長，抑制率達到18.36%，表現出一定的正常細胞毒性，因此藻藍蛋白及其酶解肽具有選擇性的細胞毒活性，而目前的化療藥物，如5-Fu，是無法做到的。相比之下，藻藍蛋白酶解肽T4則顯示出無法比擬的優勢。

圖5 藻藍蛋白酶解肽混合物的全波長掃描圖Fig.5 Full wavelength scanning spectrum of C-PC hydrolysate

圖6 酶解肽T4的全波長掃描圖Fig.6 Full wavelength scanning spectrum of peptide T4

為了進一步了解組分4與混合肽一些特性，分別對同樣質量濃度的組分4與混合肽作了全波長掃描，結果如圖5、6所示。藻藍蛋白酶解肽在280、360nm和620nm波長處有特征吸收峰，這一點和酶解前的藻藍蛋白(圖3)類似。但620nm波長處的吸收峰強度明顯減弱，而280nm和360nm波長處的吸收峰強度增強，且超過了620nm波長處的吸收峰強度。這可能是因為酶解破壞了藻藍蛋白的三級結構引起的光譜性質變化。同時，經過分離純化的肽組分4與混合肽相比，在紫外區吸收光譜存在顯著差異。同樣質量濃度條件下，在360nm處吸收峰強度增強，且在280nm波長處吸收峰明顯減弱并在接近200nm處多出一個吸收峰，經數據測量，其在紫外區的3個特征吸收峰分別在228、276nm和356nm處。純化后的T4與混合肽在光譜掃描曲線的差異也在一定程度上反映了分離純化的效果。

在藻藍蛋白酶解產物研究中，黃蓓等[20]報道了3種經過胰蛋白酶水解的藻藍蛋白色素肽(其分子質量為17.4、7.72kD和6.6kD)，并研究了其對小鼠肉瘤細胞S180的細胞毒性實驗和荷瘤小鼠的光動力學抗腫瘤(photodynamic therapy，PDT)實驗，發現其具有良好體外腫瘤抑制效果和PDT效果。經本實驗室前期對藻藍蛋白酶解工藝條件和對腫瘤細胞研究對象的摸索，發現相同酶解條件的產物對不同的腫瘤細胞系作用差別很大，且用兩種蛋白酶通過正交試驗等方法得到了抑制HeLa和B16細胞增殖的藻藍蛋白最佳酶解條件[20]，本實驗采用胰蛋白酶酶解藻藍蛋白，以HeLa細胞為作用對象，以期找到藻藍蛋白分子中包含的相應抗腫瘤活性肽。本實驗采用的鈍頂螺旋藻其α和β亞基的分子質量分別為17.0kD和19.6kD，通過對T4的HPLC液相色譜分析顯示T4主要由兩個組分，Maldi-TOF-MS肽譜分析(結果未顯示)，有兩個組分的信號明顯高于其他組分，且這兩個成分的分子質量分別為1038.459D和1151.556D。根據藻藍蛋白的α和β亞基的氨基酸序列與結構以及胰蛋白酶對于賴氨酸(K)和精氨酸(R)殘基中的羧基特定作用位點，得知α和β亞基各應具有18個酶切位點，因此在本實驗理論指導的酶解工藝下和初步分析測定表明，酶解肽組分4的分子質量明顯小于5kD。

此外，本實驗僅是應用胰蛋白酶簡單模擬體內環境對藻藍蛋白進行酶解加工研究，而當藻藍蛋白被食用后，經過腸胃道更復雜的消化作用，進而影響機體的細胞因子網絡，正應是其內的功能肽段作用暴露出來作用的結果。因此深入研究藻藍蛋白活性肽段的結構特性及其作用機制，具有很重要的意義。本實驗室后期將對T4活性肽進行進一步深入分析與鑒定工作。

3 結 論

采用改進的鹽析工藝對藻藍蛋白粗提液反復鹽析，得到純度為A620nm/A280nm=2.19的藻藍蛋白粗提物，后經羥基磷灰石柱層析和Sephacryl S-200 HR柱層析純化，得到純度為A620nm/A280nm=3.89的藻藍蛋白。

用胰蛋白酶水解得到的藻藍蛋白酶解肽，經DEAE Sepharose FF柱層析分離并經純化得到4個組分。其對HeLa細胞的生長抑制率分別為37.71%、24.08%、27.88%和47.04%，混合肽抑制率34.02%，藻藍蛋白的抑制率為26.03%。組分1和4的抑制率高于混合肽，其中組分4作用效果最理想，且對正常細胞293T無抑制作用，為潛在的抗腫瘤活性肽組分。

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Purification and Cytotoxicity of C-Phycocyanin(C-PC) from Spirulina platensis and Its Tryptic Peptides

WANG Xue-qing，DENG Wei，YANG Jin-fang，MAO Yu-cong，SHI Zhong-ming
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

This paper deals with the separation, purification and cytotoxicity of C-phycocyanin (C-PC) from Spirulina platensis and its tryptic peptides. Repeated freezing and thawing coupled with ultrasonic treatment was used for disrupting the cell wall of Spirulina platensis. The purity (A620nm/A280nm) of C-PC was 2.19 after fractional precipitation by 28-55 g/100 mL (NH4)2SO4 and could reach 3.89 after further purification by sequential chromatography on hydroxylapatite (HA) column and Sephacryl S-200 HR gel column. The purified C-PC was hydrolyzed by trypsin at 40 ℃ for 60 min. Four peptides were obtained from the hydrolysate of C-PC by DEAE-Sepharose Fast Flow column chromatography. The cytotoxicity of C-PC and its hydrolysate as well as the 4 peptides on HeLa and 293T cells was evaluated by MTT assay. The results showed that the inhibition rates of peptide fractions I and IV, C-PC hydrolysate and C-PC on the growth of HeLa cells were 37.71%, 47.04%, 34.02% and 26.03%, respectively. Therefore, peptide fractions I and IV revealed obvious suppressive effect on the proliferation of cancer cells, while neither of them had cytotoxicity on 293T cells. Moreover, peptide fraction IV had the strongest tumor suppression activity, indicating a great potential to be developed as health-care products.

C-phycocyanin；purification；hydrolyzed peptide；cytotoxicity

R284.2；R151.41

A

1002-6630(2012)01-0136-05

2011-07-20

天津市基礎研究重點項目(08JCZDJC16600)；天津商業大學SRT項目(2011-57)

王雪青(1964—)，女，教授，博士，主要從事天然活性物質的研究與開發。E-mail：wxqing@tjcu.edu.cn