三江鎮腌菜中降解亞硝酸鹽乳酸菌的篩選和初步鑒定

劉志文，袁偉靜，張三燕，羅 靜，陳忠良，李昆太，郭曉燕，徐 波,*

(1.江西農業大學生物科學與工程學院，南昌市發酵應用技術重點實驗室，江西 南昌 330045；2.北京市立新學校，北京 100037；3.南方醫科大學第二臨床醫學院，廣東 廣州 510515)

三江鎮腌菜中降解亞硝酸鹽乳酸菌的篩選和初步鑒定

劉志文1，袁偉靜2，張三燕1，羅 靜3，陳忠良1，李昆太1，郭曉燕1，徐 波1,*

(1.江西農業大學生物科學與工程學院，南昌市發酵應用技術重點實驗室，江西 南昌 330045；2.北京市立新學校，北京 100037；3.南方醫科大學第二臨床醫學院，廣東 廣州 510515)

為篩選具有較強降解亞硝酸鹽能力的乳酸菌，本實驗經過初篩和復篩從三江鎮雪里蕻腌菜中篩選出降解亞硝酸鹽能力相對較強的乳酸菌菌株。篩選結果顯示菌株對亞硝酸鹽最強降解能力達到68h平均降解量32.66μg/mL。采用十六烷基三甲基溴化銨法(CTAB)法提取降解亞硝酸鹽能力最強的乳酸菌11號菌株的基因組，測序后進行Blast同源性比較，其與Lactobacillus fermentum strain PL9005的同源性達到98%，并選取同源性較高的菌株構建系統發育進化樹，初步鑒定該菌株為Lactobacillus fermentum。

乳酸菌；亞硝酸鹽降解；篩選；鑒定

我國蔬菜年總產量數億噸，蔬菜深加工是農民增收的有效途徑，如傳統發酵食品——醬腌菜是主要的蔬菜加工種類。食用醬腌菜除可吸收蔬菜營養成分外，同時還可攝入乳酸菌及其代謝產生的有機酸等，具有幫助消化，防止便秘，刺激腸道免疫細胞產生抗體，預防疾病，抑制腸道腐敗細菌生長，減弱腐敗菌在腸道產毒，防止細胞老化，降低膽固醇，調節人體生理功能等保健和醫療作用[1]。隨著人們食品安全意識的提高，醬腌菜亞硝酸鹽積累及有害微生物污染的安全性問題也日益受到人們的關注[2-3]。研究降解亞硝酸鹽的方法和機理，對傳統工藝進行創新和發明，提高醬腌菜的科技含量，完善醬腌菜工業化生產進程有重要作用，有利于我國傳統醬腌菜走向世界[4-5]。

江西三江鎮的傳統特色食品“三江口蘿卜腌菜”，色澤金黃、香氣濃郁、酸辣適中、鮮香脆嫩，具有“酸、脆、香、辣”的獨特風味，起源于宋代，是唐朝貢品，與四川榨菜、揚州醬菜等齊名，素有“一寸腌菜一寸金”之美譽，深受消費者喜愛。經檢測發現其亞硝酸鹽含量遠低于一般市面上的醬腌菜中亞硝酸鹽含量，因此本實驗從三江鎮腌菜中分離、篩選和鑒定降解亞硝酸鹽的乳酸菌，為研究降低亞硝酸鹽的機理，建立可控降解醬腌菜中亞硝酸鹽的發酵體系，獲得優質、安全的醬腌菜制品，以及新型醬腌菜的工業化生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種

前期實驗從三江鎮腌鹽菜中分離、篩選得到17株乳酸菌，分離及鑒定方法參照文獻[6]，由江西農業大學生物科學與工程學院保存。

1.2 儀器與設備

S3005060030型顯微鏡 江西鳳凰光學儀器有限公司；WD-9403E型紫外分析儀、Spee-trAA-10型原子吸收分光光度計、DYY-6B型穩壓穩流電泳儀 北京市六一儀器廠；高速冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠；DNA基因擴增儀 德國Biometra公司。

1.3 試劑的配制

MRS、H2S實驗培養基、甲基紅培養基、LB固體培養基的配制參照文獻[7]；亞鐵氰化鉀溶液、乙酸鋅溶液、飽和硼砂溶液、對氨基苯磺酸溶液、鹽酸萘乙二胺溶液、亞硝酸鈉標準溶液的配制參照文獻[8]；TE、裂解緩沖液、溴化十二烷基三甲基銨(CTAB)的配制參照文獻[7]；溶菌酶、蛋白酶K、RNase、Taq DNA聚合酶、dNTP 上海生工生物工程技術服務有限公司。

1.4 方法

1.4.1 降解亞硝酸鹽乳酸菌的初篩

將1.1節17株乳酸菌于MRS液體培養基中進行活化，取種齡為18h的菌種，按1‰接種量接種于200mL含125μg/mL NaNO2，pH6.0的MRS液體培養基中，30℃培養。于20、44、68h定時取樣，檢測發酵液中NaNO2含量，同時做不接種對照實驗。

1.4.2 降解亞硝酸鹽乳酸菌的復篩

將初篩得到的菌株于MRS液體培養基活化后，取種齡18h的菌種，接種于含適量NaNO2的磷酸鉀、磷酸鈉緩沖液的MRS液體培養基中，每隔24h定時檢測發酵液中的NaNO2含量，同時做不接種培養基對照。

1.4.3 菌種鑒定

形態結構觀察及生理生化實驗參照文獻[9]進行。

1.4.4 發酵液中亞硝酸鹽含量的測定

采用GB/T 5009.33—2003《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中的鹽酸萘乙二胺法對亞硝酸鹽進行測定。

標準曲線繪制：分別準確稱取0、1、2、3、4、5、7.5、10、12.5μg NaNO2，加入40mL水和2mL對氨基苯磺酸溶液，混勻，避光靜置5min，再加入1mL鹽酸萘乙二胺溶液，混勻并定容至50mL，避光靜置15min，測OD538nm值。得標準曲線回歸方程為：y＝0.6502χ-0.0058，R2＝0.995。

試樣處理：將12.5mL飽和硼砂液加入于5.0mL發酵液中，再加入40mL蒸餾水后沸水浴加熱15min，冷卻至室溫后加入5mL亞鐵氰化鉀溶液，再加入5mL乙酸鋅溶液混勻。靜置30min以沉淀蛋白質。將上述液體定容至100mL。過濾后，棄去初濾液5mL，收集剩余濾液備用。

樣品測定：取2.00mL上述處理液加入40mL水，2mL對氨基磺酸溶液，混勻后避光靜置5min，再加入1mL鹽酸萘乙二胺溶液后定容至50mL后，避光靜置15min，測OD538nm值，同時以等量蒸餾水做空白對照。

1.4.5 乳酸菌基因組DNA提取

采用十六烷基三甲基溴化銨法(CTAB)法提取乳酸菌的基因組DNA[7]。

1.4.6 16S rRNA菌種鑒定

將提取的乳酸菌基因組送交上海生工生物工程技術服務有限公司測序16S rRNA，根據得到的結果與GenBank中相關菌株基因組序列進行同源性比較。

1.4.7 構建系統發育進化樹

根據測序所得的16S rRNA全序列在NCBI網站上進行Blast比對后，選取與目的序列同源性較高(最好是大于97%)的乳酸菌菌種序列，構建系統發育進化樹。

2 結果與分析

2.1 降解亞硝酸鹽乳酸菌的初篩結果

表1 初篩菌株發酵液中亞硝酸鹽降解量Table1 Nitrite degradation ability of different lactic acid bacterium strains isolated from Sanjiang pickle pickled potherb mustard

由表1可看出，隨著發酵時間的延長，發酵液中亞硝酸鹽含量都有所降低。在同一時間，乳酸菌菌株不同，發酵液中亞硝酸鹽降解量也不同。但由于乳酸菌在代謝過程中可產生乳酸，乳酸對亞硝酸鹽具有一定的降解作用，故從以上菌株中選取68h平均降解量大于26.08μg/mL的菌株(5、9～16號)，接種于含磷酸鹽緩沖液的MRS培養基中進行復篩。

2.2 降解亞硝酸鹽乳酸菌的復篩

表2 培養液中亞硝酸鹽降解量Table2 Nitrite degradation ability of primarily screened straμings/mL

由于含磷酸鹽緩沖液的MRS培養基的pH值均始終維持在6.0以上，由張慶芳等[10]的研究結果可知，在pH4.5以上，乳酸菌對亞硝酸鹽的降解作用主要以其代謝產生的酶降解為主，結合本實驗表2結果可判斷，經復篩的乳酸菌具有降解亞硝酸鹽的酶系，但不同菌株之間對亞硝酸鹽的降解能力有所差異，其中以11號菌株的降解能力最強。同時可看出，磷酸鉀、磷酸鈉兩種緩沖體系對乳酸菌對亞硝酸鹽的降解作用無明顯差異。

2.3 11號菌株形態特征鑒定結果

經分離的11號菌株在MRS固體培養基中培養3d后，菌落呈乳白色，表面光滑，隆起，菌落邊緣整齊，菌落直徑小于或等于1mm，如圖1所示。經革蘭氏染色和鏡檢后發現菌株為革蘭氏陽性菌，且不產生芽孢。

圖1 11號菌株的平板菌落形態Fig.1 Strain No.11 on the plate

2.4 生理生化實驗鑒定結果

所篩11號菌株在過氧化氫酶反應實驗中不產氣泡，為陰性反應；在醋酸鉛試紙反應實驗中變黑，呈陽性反應；甲基紅實驗時甲基紅試劑由橙黃色變為紅色，陽性反應。由2.3節和2.4節實驗結果可以初步將所篩選的11號菌株鑒定為乳酸菌。

2.5 基因組提取檢測結果

采用瓊脂糖凝膠電泳檢測提取11號菌株基因組DNA，其結果如圖2所示，由圖2可判斷，采用CTAB法提取的基因組DNA效果較好，2號泳道具有明顯的Smear拖尾條帶，說明提取的基因組DNA比較完整，有利于16S rRNA的測序比對。

圖2 11號菌株DNA基因組電泳檢測結果Fig.2 Ggarose gel electrophoresis analysis of the No. 11 strain genome extracted

2.6 16S rRNA同源性分析及序列比對結果

取得11號菌株16S rRNA 序列后，從GenBank基因數據庫中調取Lactobacillus fermentum PL9005的16S rRNA序列進行同源性比較，結果顯示11號菌株16S rRNA 序列片段(1133bp)與Lactobacillus fermentum PL9005的同源性較高，達到98%，可初步確定11號菌株與Lactobacillus fermentum PL9005的進化關系接近，結果如圖3所示。

圖3 11號菌株的16S rRNA基因組序列與相關菌株基因組序列的同源性比對Fig.3 Homologous alignment of 16S rRNA sequences of strain No. 11 and related strains

2.7 系統發育進化樹構建結果

將11號菌株16S rRNA全序列在NCBI網站上進行Blast比對后，選取適當數量同源性較高的不同菌株構建系統發育進化樹，由圖4可見，11號菌株與Lactobacillus fermentum PL900516親緣關系最近，可初步確定11號菌株即為 Lactobacillus fermentum。

圖4 系統發育進化樹構建結果Fig.4 Polygenetic tree based on the complete 16S rRNA sequence of strain No. 11

3 討 論

在發酵液中亞硝酸鹽含量測定實驗中，由于亞硝酸鹽易吸水潮解，故在配制亞硝酸鈉標準溶液時，須將其烘干。因對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺見光易發生副發應，所以兩種試劑配制好后一定要避光保存，當加入上述兩種試劑后溶液也應避光以免發生副反應。

所篩選的乳酸菌11號菌株的16S rRNA序列(1133bp)與Lactobacillus fermentum strain PL9005的同源性達到98%，根據序列同源性的不同，系統發育進化樹的構建方法也不同。如模型合適，最大似然(ML)的效果最好，對于近緣序列，簡約(MP)的效果較好，而對于同源性不很高的序列，一般用鄰近(NJ)或ML。本研究所得序列在Blast上進行同源性比對后發現與其他菌種序列的同源性除個別較高之外，其余的同源性都不太高，因而在構建系統進化樹時采用NJ法構建[11]。根據實驗結果，可初步確定11號菌株為Lactobacillus fermentum。

利用乳酸菌進行醬腌菜的純種和混合發酵，可減少有害菌的影響并顯著降低醬腌菜中亞硝酸鹽含量，既可提高蔬菜的營養保健作用，又可使蔬菜增效、增值[4-5]。本實驗從三江鎮腌菜中選育出高效降解亞硝酸鹽的優良乳酸菌菌株，在此基礎上擬將亞硝酸還原酶基因(nirS)克隆到乳酸乳球菌中進行高效誘導表達[12]，分析純種培養在腌菜制作中降解亞硝酸鹽的可行性，為其在食品中的應用奠定基礎。

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Screening and Preliminary Identification of a Lactic Acid Bacterium Strain with the Capacity of Nitrite Degradation from Sanjiang Pickled Potherb Mustard

LIU Zhi-wen1，YUAN Wei-jing2，ZHANG San-yan1，LUO Jing3，CHEN Zhong-liang1，LI Kun-tai1，GUO Xiao-yan1，XU Bo1,*
(1. Nanchang Key Laboratory of Applied Fermentation Technology, College of Bioscience and Engineering, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China；2. The Lixin College of Beijing, Beijing 100037, China；3. Second Clinical Medical College of Southern Medical University, Guangzhou 510515, China)

A strain of lactic acid bacteria with strong ability to degrade nitrite was screened from pickled potherb mustard made in Sanjiang town, Jiangxi province. The strongest ability of the strain to degrade nitrite averagely reached 32.66 μg/mL during 68 h of fermentation. The results of 16S rRNA sequencing showed that this strain was 98% homologous to Lactobacillus fermentum PL9005. Polygenetic analysis indicated that this strain belonged to Lactobacillus fermentum.

lactic acid bacteria；nitrite degradation；screening；identification

Q939.97

A

1002-6630(2012)01-0166-04

2011-09-05

江西省教育廳科研基金項目(GJJ11407)；南昌市科技局科研基金項目(洪科發計字(2011)158-52)；江西省科技廳科技支撐項目(2009BNB05704)

劉志文(1967—)，女，實驗師，本科，研究方向為微生物學。E-mail：zhiwenliu1967@sohu.com

*通信作者：徐波(1970—)，男，副教授，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：xubo583@sina.com