酶解豬血紅蛋白制備降血壓肽工藝參數優化

李 誠，郭奇亮,2，付 剛，陳代文，鄒沫君

(1.四川農業大學食品學院，四川 雅安 625000；2.成都市農林科學院，四川 成都 611130)

酶解豬血紅蛋白制備降血壓肽工藝參數優化

李 誠1，郭奇亮1,2，付 剛1，陳代文1，鄒沫君1

(1.四川農業大學食品學院，四川 雅安 625000；2.成都市農林科學院，四川 成都 611130)

為獲得具有較高降血壓活性的降血壓肽，選用胰蛋白酶對豬血紅蛋白進行水解。以水解物對血管緊張素轉化酶(ACE)抑制率為指標，先進行單因素試驗，確定底物質量濃度、水解溫度、pH值、酶用量及水解時間5個因素的最適水平范圍，再通過正交試驗對酶解工藝參數進行優化。結果表明胰蛋白酶水解豬血紅蛋白制備降血壓肽的最佳酶解條件為：底物質量濃度10g/100mL、水解溫度45℃、pH8.0、水解時間8h、酶用量2000U/g，此時酶解產物對血管緊張素轉化酶的抑制率為68.74%。

降血壓肽；豬血紅蛋白；胰蛋白酶；酶解工藝

高血壓病是一種常見的多發病。據估計，目前世界1/4的成年人患有高血壓，這一數據預計到2025年會增加到30%[1]。全球范圍內約有760萬人由于高血壓病早逝，約占全球病死率13.5%；由高血壓引起的腦卒中和缺血性心臟病分別達54%和47%[2]。藥物治療高血壓病雖然可以起到一定的作用，但是藥物具有強烈的副作用，嚴重影響著人們的身心健康。人們迫切希望找到一種可以代替藥物的食源性降血壓產品。

血管緊張素轉化酶抑制肽(angiotensin converting enzyme inhibitory peptides，ACEIP)又稱ACE抑制肽，是一類具有降血壓作用的多肽的總稱。ACEIP的突出優點是能有效降低原發性高血壓患者的血壓，而對正常人卻沒有降血壓作用，也不會產生其他副作用。早在1965年，國外學者Ferreira[3]首次從巴西蝮蛇蛇毒中分離出具有ACE抑制活性的多肽，1982年，Maruyama等[4]發現利用胰蛋白酶酶解酪蛋白之后的產物具有體外ACE抑制活性。隨后，越來越多的研究人員分別從不同的食物蛋白酶解產物中分離得到具有降血壓活性的多肽，報道的食物有螃蟹、牛肉、蛋黃、玉米等[5-8]。豬血紅蛋白經酶解制備的多肽不僅具有易溶解、低黏度、抗凝膠形成等良好的功能特性，而且具有降血壓、降血脂、抗衰老、提高免疫力、緩解心血管疾病以及肥胖癥等重要的生理活性[9]。Mito等[10]等用胃蛋白酶酶解豬血紅蛋白得到了抗高血壓肽；Man Jin等[11]依次用外肽酶Flvourzyme和內肽酶Esperase水解豬的血紅蛋白得到富含亞鐵血紅素的低分子質量的小肽；有研究表明豬血經胰蛋白酶水解得到可增強機體免疫活性的多肽[12]。酶解制備降血壓肽的研究報道比較多，但各研究所用酶的種類、酶解參數(特別是酶的用量)及酶解效果差異比較大。

本研究采用胰蛋白酶對豬血紅蛋白進行水解，對降血壓肽制備工藝參數進行優化，以期在較少酶用量情況下獲得具有較高降血壓活性的降壓肽，為利用豬血紅蛋白制備、開發降血壓肽提供理論依據和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豬血 雅安市大興屠宰場。

胰蛋白酶(Trypsin，酶活力1:250) 美國Amresco公司；血管緊張素轉化酶(ACE)、馬尿酸-組氨酸-亮氨酸(HHL) 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

BR4i型多功能冷凍離心機 美國Thermo公司；UV-2102 PCS型紫外-可見分光光度計 美國Unico公司；BT-12S電子天平 德國Sartorius公司；PHS-3C酸度計方舟科技公司。

1.3 方法

1.3.1 豬血紅蛋白的制備

本實驗改良Zhao Qiuyu等[13]的方法。在屠宰過程中采集血液(按3g/L加入檸檬酸鈉抗凝)，于低溫條件下(冰塊降溫)運回實驗室冷藏。在4℃條件下將血液9000×g高速冷凍離心10min，得到上層血漿和下層血細胞。棄去血漿，將血細胞加入同等體積的生理鹽水沖洗并離心兩次后加入等體積去離子水，在不斷攪拌下超聲波處理20min輔助溶血，之后4℃條件下4000×g冷凍離心10min，得到上清血紅蛋白液于4℃冰箱保存備用。

1.3.2 酶解條件優化

胰蛋白酶水解豬血紅蛋白制備降血壓肽基本過程：按設定的底物質量濃度取豬血紅蛋白液，根據不同的反應條件調節溫度、pH值和酶加入量，水解至設定的時間，最后沸水浴10min滅酶。在4℃、10000×g離心5min，收集濾液備用。另取豬血紅蛋白用去離子水溶解，作為非酶解對照液。

1.3.2.1 酶解條件單因素試驗

分別考察底物質量濃度、水解溫度、pH值、酶用量、水解時間5個因素對豬血紅蛋白酶解產物ACE抑制率和水解度的影響。底物質量濃度的影響：設定豬血紅蛋白質量濃度4、6、8、10、12g/100mL，其他條件為溫度45℃、pH8.0、酶用量6000U/g、水解時間6h。水解溫度的影響：設定水解溫度35、40、45、50、55℃，其他水解條件為底物質量濃度5g/100mL、pH8.0、酶用量6000U/g、水解時間6h。pH值的影響：設定pH值為6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，其他水解條件為底物質量濃度5g/100mL、水解溫度45℃、酶用量6000U/g、水解時間6 h。酶用量的影響：設定酶用量：2 00 0、4000、6000、8000、10000U/g，其他水解條件為底物質量濃度5g/100mL、水解溫度45℃、pH8.0、水解時間6h。水解時間的影響：設定水解時間2、4、6、8、10h，其他水解條件為底物質量濃度5g/100mL、水解溫度45℃、pH8.0、酶用量6000U/g。

1.3.2.2 正交試驗優化酶解條件

在單因素試驗結果基礎上，按五因素四水平L16(45)設計正交試驗，以蛋白質水解物ACE抑制率為指標，研究最佳酶解條件。

1.3.3 指標測定

1.3.3.1 豬血紅蛋白液的蛋白質含量測定

參照GB/T 5009.5—2003《食品中蛋白質的測定》方法測定。

1.3.3.2 蛋白酶活力測定

參照SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測定法》中的福林法測定，根據蛋白酶活力確定加酶量。

1.3.3.3 ACE抑制率測定

參照Cushman等[14]的方法。

1.3.3.4 蛋白質水解度測定

采用甲醛滴定法[15]。

1.3.4 數據統計分析

采用SPSS12.0軟件對結果進行數據分析，對單因素試驗結果的ACE抑制率和水解度采用二變量Pearson相關系數分析相關性。對正交試驗結果，根據極差分析各個酶解參數水平變化對酶解產物ACE抑制率影響的主次順序；用方差分析各個因素對胰蛋白酶水解豬血紅蛋白產物的ACE抑制率影響的顯著性；采用處理間多重比較法(LSD法)分析各個因素間的相互作用，確定最佳酶解因素水平組合。

2 結果與分析

2.1 底物質量濃度的影響

圖1 底物質量濃度對胰蛋白酶酶解豬血紅蛋白水解度及產物ACE抑制率的影響Fig.1 Effect of substrate concentration on hydrolysis degree and ACE inhibitory rate of porcine hemoglobin

由圖1可知，隨著底物質量濃度的增加，胰蛋白酶酶解豬血紅蛋白的水解度和水解產物的ACE抑制率都上升。底物質量濃度從4～12g/100mL，質量濃度每增加2g/100mL，水解度分別增加2.43%、0.75%、0.79%和0.62%，產物ACE抑制率的增長分別為4.14%、3.57%、2.88%和1.27%。隨著底物質量濃度增加，雖然水解度和產物ACE抑制率都有增加，但是增加的幅度越來越小。底物質量濃度從10g/100mL增加到12g/100mL時，其水解度及產物ACE抑制率的增加幅度最小，因此確定10g/100mL及以下為最適宜的底物質量濃度。

2.2 水解溫度的影響

圖2 水解溫度對胰蛋白酶酶解豬血紅蛋白水解度及產物ACE抑制率的影響Fig.2 Effect of temperature on hydrolysis degree and ACE inhibitory rate of porcine hemoglobin

由圖2可知，水解度與產物ACE抑制率都是先上升后下降，并且都是在溫度為40～45℃間達到峰值，40～45℃為最適宜溫度。當溫度達到55℃時，水解度和產物ACE抑制率已經大幅下降。因此選擇35、40、45℃和50℃為適宜的水解溫度。

2.3 pH值的影響

圖3 pH值對胰蛋白酶酶解豬血紅蛋白水解度及產物ACE抑制率的影響Fig.3 Effect of pH on hydrolysis degree and ACE inhibitory rate of porcine hemoglobin

由圖3可知，在pH8.0時酶解水解度和產物的ACE抑制率都達到峰值。而pH6.0時，水解度和產物ACE抑制率是所有條件下最低的，故選擇pH值為7.0、8.0、9.0和10.0為適宜的酶解條件。

2.4 酶用量的影響

圖4 酶用量對胰蛋白酶酶解豬血紅蛋白水解度及產物ACE抑制率的影響Fig.4 Effect of enzyme dosage on hydrolysis degree and ACE inhibitory rate of porcine hemoglobin

由圖4可知，隨著酶用量的增加，胰蛋白酶酶解豬血紅蛋白的水解度和產物的ACE抑制率都上升。隨著酶用量的繼續增加，水解度的增加比較平緩，而產物ACE抑制率一直保持著較高增長率。考慮酶用量的增加導致成本增加，因此選擇2000、4000、6000U/g和8000U/g為適宜的酶用量。

2.5 水解時間的影響

圖5 水解時間對胰蛋白酶酶解豬血紅蛋白水解度及產物ACE抑制率的影響Fig.5 Effect of hydrolysis time on hydrolysis degree and ACE inhibitory rate of porcine hemoglobin

由圖5可知，在酶解前期，酶解水解度和產物的ACE抑制率都快速上升，而從6h開始，水解度和產物的ACE抑制率增長速度趨于平緩，8h后增長幅度不大。因此選擇2、4、6h和8h為適宜的水解時間。

2.6 酶解條件優化試驗結果

2.6.1 正交試驗設計及結果

酶解條件優化正交試驗設計及結果與分析分別見表1～3。

表1 正交試驗因素水平表Table1 Coded values and corresponding real values of the optimization parameters tested in orthogonal array design

表2 正交試驗設計及結果Table2 Orthogonal array design and results

表3 正交試驗結果方差分析Table3 Variance analysis for the experimental results of orthogonal array design

根據表2極差分析，各因素對酶解產物ACE抑制率影響的主次順序依次為C＞A＞D＞B＞E，即pH值＞底物質量濃度＞水解時間＞水解溫度＞酶用量。從表3的方差分析可以看出，底物質量濃度、水解溫度、pH值、水解時間4個因素對胰蛋白酶酶解豬血紅蛋白產物的ACE抑制率的大小均有極顯著的影響，酶用量對胰蛋白酶酶解豬血紅蛋白產物的ACE抑制率的大小無顯著影響，區組間影響差異不顯著。

2.6.2 各試驗處理平均數多重比較(LSD法)

表3結果顯示，除酶用量對酶解產物ACE抑制率無顯著影響外，其他4個因素都有極顯著影響。因此有必要進行各個試驗處理間的多重比較以確定最優水平組合。根據最小顯著差數法計算各處理每兩組間的差值和最小顯著差數LSDα：LSD0.05=2.84，LSD0.01=3.91。

多重比較結果表明，除幾個試驗組間(包括試驗組11號與4號，試驗組16號與5號、8號、9號、13號，試驗組13號與8號、9號，試驗組8號與9號，試驗組2號與10號)差異不顯著外，其余各試驗處理組間差異都是顯著或極顯著，說明該正交試驗可以篩選確定出最優組合。其中，15號試驗處理組與其他處理間差異都為顯著或極顯著。結合極差分析和方差分析，酶用量是最為次要的影響因素。從降低成本考慮，選擇最小的酶用量，可以確定15號處理組為最優水平組。因此確定胰蛋白酶水解豬血紅蛋白的最佳工藝參數組合為A4B3C2D4E1，即pH8.0，底物質量濃度10g/100mL，水解時間8h，水解溫度45℃，酶用量2000U/g。

3 結 論

采用胰蛋白酶酶解豬血紅蛋白制備降血壓肽的單因素試驗表明胰蛋白酶酶解豬血紅蛋白的水解度與水解產物的ACE抑制率相關性顯著，ACE抑制率隨著水解度的增減而增減。正交試驗表明，酶用量對酶解產物ACE抑制率的影響最小，各種酶解參數對酶解產物ACE抑制率的影響大小順序為：pH值＞底物質量濃度＞水解時間＞水解溫度＞酶用量；酶用量對胰蛋白酶酶解豬血紅蛋白產物的ACE抑制率無顯著影響；胰蛋白酶水解豬血紅蛋白制備降血壓肽的最佳酶解條件為底物質量濃度10g/100mL，水解溫度45℃，pH8.0，水解時間8h，酶用量2000U/g，在此條件下水解產物的ACE抑制率為68.74%。

本研究對采用胰蛋白酶水解豬血紅蛋白制備降血壓肽的工藝參數進行優化，在較少酶用量情況下獲得了具有較高降血壓活性的降壓肽，不僅原料便宜，而且酶用量很少。這為低成本開發降血壓肽提供了重要的理論依據和實驗依據。

參考文獻：

[1]FERNANDEZ-MUSOLES R, LOPEZ-DIEZ J J, TORREGROSA G, et al. Lactoferricin B-derived peptides with inhibitory effects on ECE-dependent vasoconstriction[J]. Peptides, 2010, 31(10): 1926-1933.

[2]陳玲, 鄒栩. 全球心血管藥物研發動態[J]. 中國新藥雜志, 2010, 19 (1): 8-16.

[3]FERREIRA S H, ROCHA e SILVA M. Potentiation of bradykinin and eledoisin by BPF (bradykinin potentiaitng factor) from Bothrops jararaca venom[J]. Experientia, 1965, 21(6): 347-349.

[4]MARUYAMA S, SUZUKI H A. Peptide inhibitor of angiotensin I-converting enzyme in the tryptic hydrolysates of casein[J]. Agric Biol Chem, 1982, 46(5): 1393-1394.

[5]CHEUNG H S, WANG F L, ONDETTI M A, et al. Binding of peptide substrates and inhibitors of angiotensin-converting enzyme. Importance of the COOH-terminal dipeptide sequence[J]. J Biol Chem, 1980, 255 (2): 401-407.

[6]IROYUKIFUJITA H, EIICHIYOKOYAMA K, YOSHIKAWA M. Classification and antihypertensive activity of angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides derived from food proteins[J]. J Food Sci, 2000, 65(4): 564-569.

[7]MIYOSHI S, ISHIKAWA H, KANEKO T, et a1. Structures and activity of angiotensin converting enzyme in soybean hydrolysates[J]. J Agric Biol Chem, 1991, 55(3): 1318-1319.

[8]王海燕, 張佳程. 乳源ACE抑制劑(降血壓肽)的研究現狀[J]. 食品與發酵工業, 2001, 27(11): 70-73.

[9]MIGUEL M, CONTRERAS M M, RECIO I, et al. ACE-inhibitory and antihypertensive properties of a bovine casein hydrolysate[J]. Food Chemistry, 2009, 112(1): 211-214.

[10]MITO K, FUJII M, KUWAHARA M, et al. Antihypertensive effect of angiotensin Ⅰ-converting enzyme inhibitory peptides derived from hemoglobin[J]. European Journal of Pharmacology, 1996, 304(1/3): 93-98.

[11]MAN Jin, HEE J C, NAM-SOON Oh. Process development for hemeenriched peptide by enzymatic hydrolysis of hemoglobin[J]. Bioresource Technology, 2002, 84(1): 63-68.

[12]李艷偉, 江波, 伶祥山. 酶解豬血蛋白中活性肽的純化和功能研究[J]. 高等學校化學學報, 2005, 26(1): 61-63.

[13]ZHAO Qiuyu, SANNIER F, PIOT J M. Kinetics of appearance of four hemorphins from bovine hemoglobin peptic hydrolysates by HPLC coupled with photodiode array detection[J]. Biochimica et Biophysica Acta, 1996, 1295(1): 73-80.

[14]CUSHMAN D W, CHEUNG H S. Spectrophotometric assay and properties of the angiotensin converting enzyme of rabbit lung[J]. Biochemical Pharmacology, 1971, 20(7): 1637-1648.

[15]黃曉鈺, 劉鄰渭. 食品化學綜合實驗[M]. 北京: 中國農業大學出版社, 2002: 131-132.

Optimization of Process Parameters for Enzymatic Preparation of Antihypertensive Peptides from Porcine Hemoglobin

LI Cheng1，GUO Qi-liang1,2，FU Gang1，CHEN Dai-wen1，ZOU Mo-jun1
(1. College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625000, China；2. Chengdu Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Chengdu 611130, China)

In order to prepare antihypertensive peptide with high activity, trypsin was selected to hydrolyze porcine hemoglobin. The one-factor-at-a-time and orthogonal array design methods were used to optimize hydrolysis conditions such as substrate concentration, temperature, pH, enzyme dosage and time based on the ACE inhibitory rate of hydrolyzed porcine hemoglobin. The results showed that the optimal hydrolysis conditions were hydrolysis for 8 h at 45 ℃, pH 8.0, an enzyme dosage of 2000 U/g and a substrate concentration of 10 g/100 mL. Under these hydrolysis conditions, the ACE inhibitory rate of porcine hemoglobin hydrolysate was 68.74%.

antihypertensive peptide；porcine hemoglobin；trypsin；enzymatic hydrolysis process

TS201.2

A

1002-6630(2012)01-0195-05

2011-08-08

李誠(1964—)，男，教授，博士研究生，主要從事動物性食品加工與質量安全控制研究。E-mail：lichenglcp@163.com