郫縣豆瓣高酶活米曲霉選育鑒定及復合菌制曲改善酶系組成研究——郫縣豆瓣復合菌制曲改善酶系組成研究

李 峰，趙 萍，周昌豹，謝 彪

（四川省食品發酵工業研究設計院，四川 成都 611130）

郫縣豆瓣是以紅辣椒、蠶豆為主要原料，經自然接種發酵，日曬夜露形成的獨具風味的傳統特色調味品。郫縣豆瓣采用的是傳統開放式發酵工藝，生產當中的微生物都是自然接種，郫縣豆瓣發酵醅當中的微生物種類和數量受季節和氣候的影響，導致郫縣豆瓣品質不穩定，發酵周期長，這也制約了行業快速發展。因此如何縮短郫縣豆瓣發酵周期，提高產品品質，是研究的必然趨勢。

影響郫縣豆瓣生產周期的生產環節是蠶豆瓣的制曲發酵和豆瓣醬的曬露。蠶豆發酵主要是利用豆瓣曲中的米曲霉產生的各種酶類進行酶解原料，產生氨基酸態氮和糖類物質及有機酸，傳統發酵時間是2～3個月，曬露工藝主要是酵醅中的酵母和細菌將蠶豆醬中的氨基酸態氮、糖類物質及有機酸轉化為郫縣豆瓣的風味物質的過程，可見蠶豆發酵是控制發酵周期的關鍵環節。因此如何提高蠶豆醬中氨基酸態氮及糖類將有利于風味物質的形成，并縮短發酵時間。

目前很多生產企業已采用純種米曲霉生產制曲，如果縮短發酵時間會導致氨基酸態氮低、風味淡薄等問題，其原因是市售曲精中的米曲霉主要是中性蛋白酶為主，酸性蛋白酶和淀粉酶活力低。本實驗將使用從郫縣豆瓣生產過程中篩選出的高酶活米曲霉進行復合菌制曲，提高豆瓣曲總酶活，改善豆瓣曲的酶系組成，有效提高豆瓣產品氨基酸態氮和還原糖含量，縮短發酵時間提高產品品質，解決行業的共性問題。

1 郫縣豆瓣生產工藝流程

郫縣豆瓣生產工藝流程圖。

脫殼的蠶豆瓣除雜、浸泡后與曲精和面粉拌勻，進入制曲池制曲，成曲拌入鹽水在發酵池發酵。

鮮辣椒采收后經除雜、清洗、斬拌后加入食鹽，入鹽漬池貯存，然后與發酵成熟的豆瓣醬混合，經曬露后，進行加工包裝。

2 材料和試劑

主要原料：蠶豆、面粉、麩皮和豆粕。

實驗菌株：菌種ddQ-125和jcQ-93，分離自郫縣豆瓣生產企業，本實驗室保存，將ddQ-125菌株標記為A，jcQ-93菌株標記為B；市售商品曲精為C，后面將以標記菌株A、B、C進行實驗。

固體培養基：按照麩皮:豆粕為4:1的比例混勻，并加入干料量75%（v/w）的拌勻。121℃、0.1MPa滅菌45min。

主要試劑：福林試劑（Folin試劑）、二硝基水楊酸（DNS）試劑均為實驗室自配；其他試劑均購自成都百旺化學試劑公司。

主要儀器：752型紫外可見分光光度計，HH-600（0）型電子恒溫水浴鍋，LXJ-II離心沉淀機，PHS-3C型精密pH計，LRH-250A型生化培養箱，XS-18型光學顯微鏡。

3 檢測方法

3.1 酶活力測定

粗酶液制取方法：上述制得固體曲樣品中按重量加入1:20（w/v）的緩沖溶液，于40℃水浴中浸提1h，間歇攪拌，過濾得粗酶液。此粗酶液用于下述各種酶活性測定。

3.1.1 蛋白酶測定方法

采用福林酚法。

3.1.2 淀粉酶測定

樣品處理：酶液提取方法同蛋白酶測定，取5mL粗酶液，7000r/min離心30min，吸取上清液測定酶活性。

酶活測定方法：參照Michael Somogyi的方法進行測定。

3.1.3 氨基酸態氮的測定

樣品處理：稱取約20.0g已剁細的試樣置于200mL燒杯中，加入100mL水，加熱煮沸，冷卻移入200mL容量瓶中，用少量水分次洗滌燒杯，洗液并入容量瓶，并加水至刻度，混勻，將樣液過濾，濾液備用。

測定方法：采用甲醛滴定法測定樣品中郫縣豆瓣的氨態氮。

3.1.4 還原糖的測定

按照Miller的方法，采用DNS（二硝基水楊酸）比色法法測定郫縣豆瓣樣品中的還原糖。

4 實驗方法

4.1 種曲培養

按照麩皮:豆粕為4:1的比例混勻，并加入干料量75%（v/w）的水，拌勻。121℃、0.1 MPa滅菌45min，冷卻后分別接入菌種A、B、C，30℃恒溫培養72h。

4.2 單菌種制曲

將蠶豆在95℃熱水中漂燙10min 后，浸泡程度為豆肉無白心，瀝干涼冷至40℃，按照蠶豆:面粉為4:1的比例混合，再接入3%種曲充分混合，攤入曲盤中品溫控制在33℃～37℃，相對濕度90%，曲料結快翻曲，發酵時間72h出曲。成曲有茂盛的黃綠色孢子。

4.3 混合菌種制曲

同方法4.2，接入的菌種為A、B混合種曲。分別按A:B為2:1進行制曲，測定酶活。

4.4 保溫發酵

曲瓣子與鹽水按傳統工藝要求的比例混合后入池進行保溫發酵，水浴溫度在50℃～55℃，品溫在40℃～45℃，發酵周期為25d～35d成熟，制成成熟瓣子（甜瓣子）。測氨基酸態氮和還原糖。

5 結果與分析

蛋白酶的作用是將原料蠶豆及面粉中含的蛋白質，經蛋白酶分解作用，逐步降解成胨、多肽和氨基酸。有些氨基酸是呈味的，就變成豆瓣醬的風味成分。淀粉酶作用可使原料中的淀粉糖化產生葡萄糖，為曲霉、酵母菌及其他微生物提供了碳素營養，同時在豆瓣發酵階段，淀粉酶繼續將淀粉糖化，成為豆瓣的甜味成分。同時，一部分糖類作為酵母菌和乳酸菌的發酵基質轉化為乙醇和有機酸，是構成成品風味的重要成分。所以，蛋白酶、淀粉酶的協同作用對豆瓣的色、香、味均有重大影響。

5.1 單菌株酶系組成

圖1 單菌株的酶系組成Fig.1 Enzymes of the single strain

米曲霉所產蛋白酶，根據作用的最適pH值可以分為3類：酸性蛋白酶（最適pH值為3）、中性蛋白酶（最適pH值為7）、堿性蛋白酶（最適pH值為9～10）。一般郫縣豆瓣生產用米曲霉蛋白酶中，中性蛋白酶活性較強，酸性蛋白酶活性較弱。由圖1可知，菌株A酸性蛋白酶活力最強，菌株B的中性蛋白酶和淀粉酶的酶活力較菌株最強。

5.2 單菌株與復合菌種制曲過程中酶活變化

本實驗考察了菌種A、B、C及AB菌種混合制曲過程中酸性、中性蛋白酶活力及淀粉酶的變化。

圖2 制曲過程中性蛋白酶活性變化Fig.2 Changes of neutral protease activity during Qu making process

單菌株制曲的蛋白酶活力在60h時出現最高值，對照組產酶高峰在66h～70h，篩選出的菌株單菌株制曲的酶活力較高，菌株A酸性蛋白酶最高達1650U/g，菌株B中性蛋白酶活力最高達3200U/g，淀粉酶活力最高達300U/g，其中菌株B的總酶活為4300U/g，復合菌制曲其總酶活力高達4550U/g，且3種酶的活力均衡，能滿足郫縣豆瓣多種酶協調作用。

圖3 制曲過程酸性蛋白酶活性變化Fig.3 Changes of acidic protease activity during Qu making process

圖4 制曲過程淀粉酶活性變化Fig.4 Changes of amylase activity during Qu making process

5.3 酶活與發酵郫縣豆瓣氨基酸態氮、還原糖的關系

為研究實驗菌株各酶活性與發酵郫縣豆瓣指標氨態氮和還原糖的影響關系，采用保溫發酵工藝制備單菌株、復合菌株發酵郫縣豆瓣實驗，在前期對單菌株制曲酶活性變化研究基上，采用制曲時間為60h，豆瓣保溫發酵時間25d。制曲酶活及發酵樣品中氨基酸態氮和還原糖含量見附表。

附表 制曲酶活及發酵樣品中氨基酸態氮和還原糖含量Attached table Enzyme activity of Qu and content of ammonia nitrogen and reducing sugar in fermentation samples

從附表可以看出，篩選出的高酶活菌株其豆瓣醬中氨基酸態氮和還原糖含量均高于市售曲精，而混合菌株又明顯高于單菌株且氨基酸態氮含量達到1.2mg/100g、還原糖含量達到5.4%，且產品醬香濃郁，色澤紅亮。

6 結論

混合制曲的目的即在中性蛋白酶活力保持在要求的基礎上，旨在提高成曲中酸性蛋白酶和淀粉酶的活力，為后期發酵提供更充足、更高活力的酶系。

將菌株ddQ-125、jcQ-93和市售曲精單獨制曲以及菌株ddQ-125和jcQ-93混合接種發酵制曲的豆瓣曲進行保溫發酵25d，對豆瓣曲酶活及豆瓣醬氨基酸態氮和還原糖含量分析，其中菌株單獨制曲及混合制曲發酵的豆瓣醬其氨基酸態氮含量均高于市售曲精，且混合菌制曲的指標高于單獨制曲，其中氨基酸態氮含量達到1.2mg/100g、還原糖含量達到5.4%；菌株A酸性蛋白酶最高達1650U/g，菌株B中性蛋白酶活力最高達3200U/g，淀粉酶活力最高達300U/g，其中菌株B的總酶活為4300U/g，復合菌制曲其總酶活力高達4550U/g，且3種酶的活力均衡，可見復合菌制曲提高了豆瓣曲綜合酶活力，克服了單菌種制曲酶系不均衡的問題，能為豆瓣發酵提供充足的酶系，有效提高氨基酸態氮和還原糖含量，為縮短發酵時間奠定物質基礎，為郫縣豆瓣規范化生產和規模化生產提供技術保障。

通過實驗，郫縣豆瓣產品在保持傳統郫縣豆瓣特色的前提下，縮短生產周期1/3（傳統工藝發酵期為50d～60d），氨基氮含量達0.8g/100g～1.2g/100g，豆瓣醬的醬酯香味明顯增加。對篩選出的菌株培養的豆瓣曲及發酵產品進行黃曲霉毒素的檢測，其黃曲霉毒素B1小于2ppb，低于國家標準5ppb，可以進一步進行生產實驗。

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