大腸桿菌工程菌利用玉米漿發酵產L-乳酸的研究

李坤朋，許雅潔，趙錦芳，王金華*

（湖北工業大學 生物工程學院發酵工程教育部重點實驗室，湖北 武漢 430068）

乳酸是一種天然存在的有機酸，廣泛存在于人體、動物、植物和微生物中[1-2]。乳酸分子中含有一個手性的碳原子，具有旋光性，從而具有L-型和D-型2種構型。當L-型和D-型乳酸等比例混合時，即為消旋的DL-乳酸。作為三大有機酸之一，乳酸、乳酸鹽及其乳酸衍生物廣泛應用于食品、醫藥、釀造、紡織、化工和印染工業[3-5]。由于人體只含有L-乳酸脫氫酶，D-乳酸無法被人體代謝，在食品添加劑和內服藥物方面D-乳酸應用受到限制。L-乳酸最具前景的應用在于聚乳酸（PLA）。PLA是一種可降解的，具有良好使用性能的生物相容性高分子材料，用于制造可生物降解塑料，近些年一直成為關注和研究的熱點[6]。隨著人們環保意識的增強和石油危機的加劇，生物塑料勢必被大量應用進而取代傳統塑料。全球最大的生物塑料生產商是NatureWorks公司，其年生產能力達14萬t。全球生物塑料年產能2020年將達80萬t～95萬t，這就表明聚乳酸無疑是今后值得期待的一種聚合物。L-乳酸作為PLA的生產原料，需求量巨大，前景非常廣闊。

目前90%以上的L-乳酸是通過微生物發酵法獲得[7]，主要以農副產品為原料，通過特定的微生物發酵生產制得光學純度很高的L-乳酸。國內外用于工業化生產L-乳酸的特定微生物主要有：乳桿菌（Lactobacillus）、芽孢桿菌（Bacillus）和根霉菌（Rhizopus）等工業微生物種屬[8]。大腸桿菌作為L-乳酸的生產菌種在國內少有文獻報道，在國外ZHOU S等[9]將乳酸片球菌Pediococcus acidilactici的ldhL基因替換掉大腸桿菌中的ldhA基因，從而得到了糖酸轉化率達95%的高光學純度L-乳酸工程菌SZ85。利用大腸桿菌產L-乳酸，相比其他微生物具有遺傳背景清楚、易于進行分子生物學操作、繁殖快、發酵周期短、營養要求粗放等優勢[10]。本實驗室應用染色體插入技術引入外源基因，構建了一株具有工業應用價值的L-型乳酸工程菌株Escherichia coliHBUT-L，其是以HBUT-D[11]為出發菌株，通過敲除其D-乳酸脫氫酶基因同時插入L-乳酸脫氫酶基因所得到的。HBUT-L能在無機鹽培養基中高效利用葡萄糖進行L-型乳酸發酵，L-乳酸光學純度達99%以上，糖酸轉化率達97%以上。雖然利用無機鹽為營養可替代成本高的有機培養基（如蛋白胨、酵母浸膏等），但仍需研究利用來源豐富、廉價的發酵底物為HBUT-L工業化生產L-乳酸打下基礎。作為一種廉價的，常常被用作細菌發酵的有機氮源，玉米漿是以玉米制淀粉或制糖中的玉米浸泡水制得的，含有可溶性蛋白、生物素、無機鹽和糖等，營養豐富[12]。本文研究了HBUT-L在以玉米漿為有機氮源，葡萄糖結晶廢糖液為碳源的玉米漿發酵培養基上，發酵生產L-乳酸，嘗試用玉米漿發酵培養基取代無機鹽發酵培養基，降低L-乳酸的發酵成本，為其工業化生產提高參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

Escherichia coliHBUT-L由本實驗構建和保藏，該菌株以本實驗室構建的高產D-乳酸工程菌HBUT-D[11]為出發菌株，敲除其D-乳酸脫氫酶基因，同時插入帶有自身啟動子序列的L-乳酸脫氫酶基因，具有良好的L-乳酸發酵特性。

1.1.2 原料和培養基

玉米漿和葡萄糖結晶廢糖液由山東濰坊盛泰藥業有限公司提供。無機鹽發酵培養基：10%葡萄糖的NBS培養基[6]。玉米漿發酵培養基：玉米漿和葡萄糖結晶廢糖液混合液，使培養基中蛋白質含量在20g/L左右，葡萄糖含量在10%左右，另外加0.1%（NH4）2HPO4和1mmol/L甜菜堿。葡萄糖滅菌條件為115℃滅菌30min，其他滅菌條件為121℃滅菌20min。

1.1.3 主要儀器和設備

1.2 方法

1.2.1 種子培養

HBUT-L在平板培養基中于培養箱中37℃培養24h～48h，接種于裝有200mL種子培養基的500mL三角瓶中，于搖床中37℃、200r/min培養16h。

1.2.2 發酵方式

發酵實驗在7L的貝朗發酵罐中進行，裝液量4L，接種量5%，37℃、200r/min培養，用6mol/L KOH作中和劑，自動調節pH值為7左右，發酵至停止加堿時結束。

1.2.3 分析方法

菌體濃度：比濁法（A600），分光光度計測量。所取發酵液樣品在10000r/min條件下離心10min，去除細胞殘留，收集上清液用于測定葡萄糖及乳酸含量。葡萄糖和乳酸濃度采用HPLC測定，檢測條件為Agilent 1200 series反相高效液相色譜儀；色譜柱：Bio-Rad HPX 87H；流動相：4mmol/L H2SO4；檢測器：示差檢測器；柱溫：35℃；進樣量：20μL；流速：0.5mL/min。乳酸光學純度采用HPLC測定，檢測條件為：色譜柱：NUCLEOSIL 120-5 Chiral-L；流動相：0.2mmol/L H2SO4；紫外檢測器240nm；柱溫：35℃；進樣量：10μL；流速：0.5mL/min。

1.2.4 計算方法

乳酸和葡萄糖濃度以發酵初始體積（4L）計算，其濃度由測量值乘以發酵體積（初始體積與加堿體積之和，取樣體積忽略不計）再除以發酵初始體積計算得到。

2 結果與討論

2.1 HBUT-L利用葡萄糖發酵產L-乳酸

HBUT-L在無機鹽發酵培養基上，以10%的葡萄糖為碳源，發酵產L-乳酸，發酵培養基中加1mmol/L甜菜堿增加菌體滲透壓耐受性[13]。從圖1和圖2可以看出，（1）HBUT-L在無機鹽發酵培養基上能夠快速生長，在4h左右進入對數期，20h左右到達穩定期，OD最大達到4.8，34h左右進入衰亡期；（2）菌體進入對數期后產乳酸產量增加，大概10h以后產酸速度明顯加快，此時的糖耗急速上升，到34h時糖基本上被消耗完，之后乳酸產量只有小幅增長，34h后加堿量變化很小，36h已停止加堿，發酵結束。

圖1 HBUT-L利用葡萄糖發酵產L-乳酸發酵進程曲線Fig.1 Fermentation process curve of HBUT-L using glucose to produce L-lactic acid

圖2 HBUT-L利用葡萄糖發酵產L-乳酸加堿曲線和pH值Fig.2 Alkali curve and pH value profile during fermentation using glucose to produce L-lactic acid by HBUT-L

HBUT-L構建的目的是使其在無機鹽發酵培養基上能高效快速利用葡萄糖發酵產高光學純度L-乳酸。在4L發酵當中，HBUT-L利用10%的葡萄糖發酵產乳酸，發酵至36h時乳酸產量可達到97.7g/L，殘糖濃度僅為0.14g/L，糖酸轉化率在97%以上，整個發酵過程乳酸生產率為2.71g/（L·h），利用手性柱實驗測得L-乳酸的光學純度在99%以上。

2.2 HBUT-L利用玉米漿發酵產L-乳酸

為降低發酵成本，以玉米漿為有機氮源，葡萄糖結晶廢糖液為碳源作為玉米漿發酵培養基來取代無機鹽發酵培養基。本實驗中所用玉米漿成分比較復雜，主要含多種氨基酸、無機鹽和維生素，成本低，營養成分適合細菌生長，另外還有少量的乳酸和糖類物質。通過計算，取一定量的玉米漿和廢糖水混合，使玉米漿發酵培養基中蛋白質含量在20g/L左右，葡萄糖含量在10%左右。為了使大腸桿菌在發酵前期更好地生長，在發酵培養中添加了少量的磷酸氫二銨作為無機氮源。此外在發酵培養基中添加少量甜菜堿，以增加菌體抗滲透壓能力。

HBUT-L利用玉米漿發酵產L-乳酸的發酵結果見圖3和圖4。發酵開始時發酵液中有4g/L的乳酸，這是因為玉米漿中含了一定量乳酸；0到6h菌體基本不產乳酸，耗糖量很少，加堿量也很少，這段時間菌體處于延遲期，菌體生長緩慢，主要合成各種酶以適應新環境；6h之后葡萄糖濃度出現小幅的上升，這可能是發酵液中某些糖類物質被菌體產生的酶水解成了葡萄糖。之后葡萄糖含量急劇下降，42h后趨于平穩，48h基本被消耗完，50h培養基中葡萄糖濃度為0.36g/L；菌體產酸速率從6h之后急劇上升，20h左右開始減小，42h后趨于零，50h乳酸濃度達到最大，為112.3g/L。由圖4可知，相應的加堿速度先快后慢，50h后停止加堿，發酵結束。

圖3 HBUT-L利用玉米漿發酵產L-乳酸發酵進程曲線Fig.3 Fermentation process curve of HBUT-L using corn steep liquor to produce L-lactic acid

圖4 HBUT-L利用玉米漿發酵產L-乳酸加堿曲線和pH值Fig.4 Alkali curve and pH profile during fermentation using corn steep liquor to produce L-lactic acid by HBUT-L

HBUT-L可在玉米漿發酵培養基上生長并產L-乳酸，其發酵結果與無機鹽發酵培養基相近。由附表可知，用玉米漿發酵培養基發酵產L-乳酸的產量要略高于無機鹽發酵培養基，但發酵時間有所延長，乳酸的產率為2.16g/（L·h），是無機鹽發酵培養基產率的79.7%。此外，玉米漿中含有部分的非葡萄糖碳源，可以被HBUT-L利用并轉化成乳酸，使乳酸產量在葡萄糖初始濃度低的條件下最后結果反而高于無機鹽發酵培養基。

附表 HBUT-L 在無機鹽發酵培養基和玉米漿發酵培養基上的發酵結果對比Attached table Comparison of HBUT-L fermentation between inorganic salts fermentation medium and corn steep liquor fermentation medium

3 結論

本實驗室構建的Escherichia coliHBUT-L菌株在無機鹽發酵培養基中能夠快速生長，并高效利用葡萄糖生產L-乳酸。在無機鹽發酵培養基上，HBUT-L在36 h里可以完全消耗10%的葡萄糖，乳酸產量可達到97.7g/L，乳酸光學純度在99%上。

HBUT-L在玉米漿發酵培養基中表現良好的發酵特性，與無機鹽發酵培養基相比，發酵時間延長至50h，葡萄糖結晶廢糖液中的葡萄糖同樣可以完全消耗掉，乳酸產量可達到108.3g/L，乳酸產率低于無機鹽發酵培養基，為2.16g/（L·h）。丁涓等[14]以玉米漿為主要有機氮源，進行嗜熱乳酸鏈球菌發酵產L-乳酸，應用響應面優化培養基，發酵72h乳酸產量11g/L，糖酸轉化率為13.1%。趙壽經等[15]利用玉米浸泡水進行干酪乳桿菌發酵產L-乳酸優化研究，發酵96h乳酸產量達到68.5g/L，糖酸轉化率為85.6%。目前國內用大腸桿菌發酵產L-乳酸的文獻報道很少，且工業化應用價值不大。與其他細菌利用玉米漿發酵產L-乳酸相比，HBUT-L乳酸產量高、光學純度高，營養需求簡單，具有明顯的工業應用優勢。本研究為開發低成本L-乳酸工業化生產提供了技術參考。

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