啤酒廢酵母酶解工藝條件的優(yōu)化

楊 宓，朱 凱*

（南京林業(yè)大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 南京 210037）

啤酒廢酵母一般指發(fā)酵4～6代后排入發(fā)酵罐內(nèi)的酵母泥，其含有豐富的蛋白質(zhì)、核酸和氨基酸等物質(zhì)，營(yíng)養(yǎng)豐富，具有多方面的保健等[1-2]功能。其中，蛋白質(zhì)含量近50%，是一種廉價(jià)的蛋白質(zhì)資源；含有人體必需的8種氨基酸，其氨基酸比例接近于聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）推薦比例，是一種寶貴的資源[3-4]。

中國(guó)是世界啤酒生產(chǎn)、消費(fèi)大國(guó)，每年在啤酒的生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生4.5萬(wàn)t左右的啤酒廢酵母，這些廢酵母除部分用作種子或經(jīng)粗加工制成飼料外，大部分被直接排放[5]，不但造成了資源的浪費(fèi)，而且增加了排水的BOD負(fù)荷[6-7]，嚴(yán)重污染了環(huán)境。所以對(duì)啤酒廢酵母進(jìn)行深加工，通過(guò)酶解制備氨基酸、核甘酸等高附加值的產(chǎn)品，這對(duì)于資源的綜合利用和環(huán)境保護(hù)都具有非常重要的意義。

本研究以啤酒廢酵母為原料，通過(guò)復(fù)合酶的酶解制備富含氨基酸的酶解液，主要利用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)對(duì)影響酵母酶解的關(guān)鍵因素進(jìn)行綜合考評(píng)，對(duì)酵母酶解的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。研究有一定的工業(yè)化應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

啤酒廢酵母：南京金陵啤酒廠；木瓜蛋白酶（酶活2.75×105U/g）、菠蘿蛋白酶（酶活4.06×105U/g）、風(fēng)味蛋白酶（酶活1.97×104U/g）、堿性蛋白酶（酶活1.18×105U/g）、復(fù)合蛋白酶（酶活1.51×105U/g）、酵母抽提酶（酶活4.23×105U/g）：廣西南寧龐博生物工程有限公司；β-葡聚糖酶（酶活5.19×105U/g）：寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司。

恒溫水浴振蕩器SHA-B（金壇市順華儀器有限公司），721分光光度計(jì)（上海航空測(cè)控技術(shù)研究所），pH計(jì)（上海雷磁），凱式定氮裝置。氨基酸分析儀（A200 amino Nova），噴霧干燥器ISO-1（天津大學(xué)北洋化工實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2 分析檢測(cè)

1.2.1 蛋白酶活力測(cè)定

按Folin-酚法[8]進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

按凱氏定氮法[9]進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3 氨基酸態(tài)氮得率測(cè)定

按甲醛滴定法[9]進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4 水解度的計(jì)算

蛋白質(zhì)水解過(guò)程中被裂解的肽鍵數(shù)與給定蛋白質(zhì)的總肽鍵數(shù)的比值稱(chēng)之為水解度（Degree of Hydrolysis，簡(jiǎn)稱(chēng)DH）。用凱氏定氮法分別測(cè)定水解上清液及水解前酵母泥中的蛋白質(zhì)含量，通過(guò)下式進(jìn)行計(jì)算[10]：

1.2.5 氨基酸分析

由江蘇省理化測(cè)試中心代為檢測(cè)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

酵母泥→水洗→0.5%NaHCO3脫苦→120 目篩分→離心→酵母泥→酶解→滅酶→離心→上清液

酵母泥用去離子水洗滌2～3次至基本沒(méi)有啤酒味，然后用0.5%NaHCO3的洗滌脫苦，再用去離子水清洗，并用120目的篩子篩分，除去酵母泥中的雜質(zhì)，然后添加酶和促溶劑NaCl酶解。酶解結(jié)束后95℃滅酶10min，離心，收集上清液，得到酵母酶解液。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合酶選擇

酵母細(xì)胞破碎程度加大有助于酵母細(xì)胞水解度的提高及水解液中氨基酸態(tài)氮得率的提高，細(xì)胞破碎的主要阻力來(lái)自于細(xì)胞壁。根據(jù)酵母細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)，在前期的實(shí)驗(yàn)中，比較了2種破壁酶：β-葡聚糖酶及纖維素酶分別與5種蛋白酶：酵母抽提酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、堿性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶復(fù)合酶解的效果，初步選出酶解效果較好的4種復(fù)配酶組合：酵母抽提酶與β-葡聚糖酶、菠蘿蛋白酶與β-葡聚糖酶、菠蘿蛋白酶與纖維素酶以及復(fù)合蛋白酶與纖維素酶4種組合，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)進(jìn)行篩選，確定最適合復(fù)合酶種類(lèi)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知，酵母抽提酶與β-葡聚糖酶復(fù)合效果最好，氨基酸態(tài)氮得率為4.25%、DH為73.45%；復(fù)合蛋白酶與纖維素酶復(fù)合效果次之，氨基酸態(tài)氮得率為4.21%、DH為72.59%；菠蘿蛋白酶與β-葡聚糖酶復(fù)合效果最差，氨基酸態(tài)氮得率僅為4.05%、DH為69.18%，菠蘿蛋白酶與纖維素酶復(fù)合與之差異不大。所以選擇酵母抽提酶與β-葡聚糖酶復(fù)合可以使細(xì)胞破碎程度較高，得到較多的小分子多肽及游離氨基酸。

表1 不同復(fù)合酶的酶解效果Table 1 Effect of different compound enzymes on enzymolysis

2.2 酵母抽提酶與β-葡聚糖酶復(fù)合酶解啤酒廢酵母工藝條件優(yōu)化

2.2.1 溫度對(duì)酶解效果的影響

在pH值為6，酶添加量1.2%，復(fù)合酶配比1:1的條件下，考察酶解溫度對(duì)酶解效果的影響，見(jiàn)圖1。

圖1 溫度對(duì)酶解效果的影響Fig.1 Effect of temperature on the enzymolysis

由圖1可知，酶解溫度對(duì)酶解效果影響十分顯著。開(kāi)始時(shí)隨著酶解溫度的上升，氨基酸態(tài)氮得率及水解度均呈快速上升的趨勢(shì)；45℃后上升趨緩，50℃時(shí)酶解效果最好，氨基酸態(tài)氮得率為4.20%，水解度為73.22%，且制得酶解液風(fēng)味比較醇厚；超過(guò)50℃后，氨基酸態(tài)氮得率明顯降低，水解度也呈緩慢降低的趨勢(shì)。這主要是由于低溫下酶的活性較低，溫度升高，酶的活性隨之上升，有利于酶解，但溫度過(guò)高會(huì)使酶由于變性而失活，不利于酶解。因此酶解溫度選擇50℃較為適宜。

2.2.2 pH值對(duì)酶解效果的影響

在溫度50℃，酶添加量1.2%，復(fù)合酶配比1:1的條件下，考察pH值對(duì)酶解效果的影響，見(jiàn)圖2。

由圖2可知，pH值＜5時(shí)，氨基酸態(tài)氮得率和水解度呈上升趨勢(shì)；當(dāng)pH值為5時(shí)，水解度達(dá)到最大，為73.72%；當(dāng)pH值＞5時(shí)，水解度緩慢降低，而氨基酸態(tài)氮得率繼續(xù)提高，pH值為6時(shí)，氨基酸態(tài)氮得率最大，為4.35%；當(dāng)pH值＞6時(shí)，水解度和氨基酸態(tài)氮得率均呈明顯下降趨勢(shì)。這是因?yàn)槊傅幕钚允躳H值影響較大，在一定pH值范圍內(nèi)，酶的活性較高，能較好的把酵母的大分子肽鏈切斷成游離氨基酸和小分子肽鏈，超出這個(gè)pH值范圍（低于或者高于），酶的活性受到一定程度的抑制，酶解效果較差。因此，酶解的初始pH值調(diào)節(jié)為6比較適宜。

圖2 pH值對(duì)酶解效果的影響Fig.2 Effect of pH value on the enzymolysis

2.2.3 酶的添加量對(duì)酶解效果的影響

在溫度50℃，pH值為6，復(fù)合酶配比1:1的條件下，考察酶的添加量對(duì)酶解效果的影響，見(jiàn)圖3。

圖3 酶的添加量酶解效果的影響Fig.3 Effect of enzyme addition on enzymolysis

由圖3可知，隨著酶添加量的不斷增加，氨基酸態(tài)氮得率和水解度都呈快速上升的趨勢(shì)，當(dāng)酶的添加量達(dá)1.2%后，上升趨緩。這主要是由于酶解反應(yīng)的初始階段，大分子蛋白質(zhì)不斷溶出，被分解為小分子多肽及游離氨基酸，氨基酸態(tài)氮得率及水解度不斷增加。當(dāng)細(xì)胞壁被打破到一定程度，大分子蛋白質(zhì)減少到一定程度，盡管酶的用量繼續(xù)增加，其與大分子蛋白質(zhì)結(jié)合的幾率有限，氨基酸態(tài)氮得率及水解度增加的幅度已經(jīng)很小。因此從酶解效果及經(jīng)濟(jì)的角度考慮，選擇酶的添加量為酵母泥干重的1.2%較為適宜。

2.2.4 酵母抽提酶與β-葡聚糖酶的配比對(duì)酶解效果的影響

在溫度50℃，pH值為6，酶添加量1.2%的條件下，考察復(fù)合酶的配比對(duì)酶解效果的影響，見(jiàn)圖4。

由圖4可知，酵母抽提酶與β-葡聚糖酶的配比為1:1，酶解效果最好，氨基酸態(tài)氮得率及水解度均達(dá)到最大值，4.23%、72.95%，這說(shuō)明酵母抽提酶與β-葡聚糖酶存在協(xié)調(diào)作用，二者并非某一種添加量偏多較好。選擇二者以等比例復(fù)合添加時(shí)，酶解的效果比較理想。

圖4 復(fù)合酶的配比對(duì)酶解效果的影響Fig.4 Effect of compound enzyme ratio on enzymolysis

通過(guò)4組單因素實(shí)驗(yàn)初步探索出符合酶解的較優(yōu)條件為：50℃條件下，酶解初始pH值為6.0，復(fù)配酶為酵母抽提酶與β-葡聚糖酶按1:1（質(zhì)量），添加量為1.2%（占酵母干重）酶解24h，制得的酶解液氨基酸態(tài)氮含量及蛋白質(zhì)水解度較高，風(fēng)味較醇厚。

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化酶解條件

響應(yīng)面設(shè)計(jì)方法是一種采用二元回歸方程來(lái)擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過(guò)對(duì)方程的分析來(lái)尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，解決多變量問(wèn)題的一種統(tǒng)計(jì)方法，適用于2～5個(gè)因素的優(yōu)化試驗(yàn)。

2.3.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

選擇溫度、pH值、復(fù)合酶配比進(jìn)行3因素的Box-Behnken擬合3水平實(shí)驗(yàn)，以水解度DH為優(yōu)化指標(biāo)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次擬合，分析各因素的主效應(yīng)和交互效應(yīng)，最終確定復(fù)合酶解的最佳條件。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平Table 2 Factors and levels of response surface experimental design

2.3.2 二次回歸模型擬合

根據(jù)表3中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以水解度為響應(yīng)值，運(yùn)用STATGRAPHICS軟件中的DOE程序進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，建立二次響應(yīng)面回歸模型。

2.3.3 方差分析

方差分析表明，模型的校正決定系數(shù)R2ADJ=0.908333，說(shuō)明該方程能解釋90.83%的響應(yīng)值變化，僅有9.17%的響應(yīng)值不能用該模型解釋。模型的決定系數(shù)R2=0.959896，說(shuō)明該模型的擬合程度良好，實(shí)驗(yàn)誤差較小，該模型是適合的，可以用來(lái)分析酵母酶解液的水解度DH。

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Response surface experimental design and results

表4 回歸方程方差分析Table 4 ANOVA of regression model

從表3的回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知，模型一次項(xiàng)X1（p=0.2030）、X2（p=0.0555）、X3（p=0.6982）均不顯著；二次項(xiàng)X12（p=0.0003）、X22（p=0.0002）、X32（p=0.0003）均極顯 著；交 互 項(xiàng)X1X2（p=0.1173）、X1X3（p=0.2394）、X2X3（P=0.1474）均不顯著。

3因素對(duì)酶解液氨基酸態(tài)氮得率影響的先后順序?yàn)椋篨2（復(fù)合酶配比）＞X1（溫度）＞X3（pH值）。

2.3.4 響應(yīng)面分析

響應(yīng)面圖形為響應(yīng)值（Y）對(duì)各實(shí)驗(yàn)因子X(jué)1、X2、X3所構(gòu)成第一個(gè)三維空間的曲面圖。從響應(yīng)面分析圖上可以找出最佳參數(shù)以及參數(shù)之間的相互作用。

圖5 酶解溫度和復(fù)合酶配比對(duì)DH的影響Fig.5 Effect of temperature and compound enzyme ratio on DH

由表4可知，酶解溫度和復(fù)合酶配比的交互作用不顯著X1X2（p=0.1173）。由圖5可以看出，固定復(fù)合酶配比，酶解溫度在49℃前DH（水解度）變化幅度較大，在49℃以后變化幅度較小；固定酶解溫度，隨著復(fù)合酶配比的增加DH成上升趨勢(shì)，接近1.0時(shí)，DH不再增加。

圖6 酶解溫度和pH值對(duì)DH的影響Fig.6 Effect of temperature and pH value on DH

由表4可知，酶解溫度和pH值的交互作用不顯著X1X3（p=0.2394）。由圖6可以看出，固定反應(yīng)溫度，隨著pH值的增加，DH呈上升趨勢(shì)，當(dāng)pH值達(dá)到6.1左右時(shí)，DH不再增加；固定pH值，隨著酶解溫度的升高，DH呈上升趨勢(shì)，當(dāng)酶解溫度接近50℃時(shí)，DH不再增加。

圖7 復(fù)合酶配比和pH值對(duì)DH的影響Fig.7 Effect of compound enzyme ratio and pH on DH

由表4可知，復(fù)合酶配比與pH交互作用不顯著X2X3（p=0.1474）。由圖7可以看出，固定pH值，復(fù)合酶配比在1.0之前DH的變化幅度較小，在1.0之后變化幅度較大；固定復(fù)合酶配比，隨著pH值的增加，DH呈上升趨勢(shì)，當(dāng)pH值達(dá)到6.1左右時(shí)，DH不再增加。

通過(guò)DOE數(shù)據(jù)處理，用二次多項(xiàng)式回歸分析求極大值，得到最大的水解度DH為73.39%，最佳酶解條件為：酶解溫度50.32℃，復(fù)合酶配比為0.94，pH值為5.98。在此工藝條件下經(jīng)過(guò)3次實(shí)際平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，DH的平均得率為73.84%，驗(yàn)證值與預(yù)測(cè)值十分接近，說(shuō)明該響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)擬合較好，比較可靠。

2.4 游離氨基酸組分分析

采用A200 amino Nova氨基酸分析儀對(duì)最佳工藝條件下制備的酵母酶解液的組分及其含量進(jìn)行分析檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖8、表5。

圖8 氨基酸分析圖譜Fig.8 Amino acids analysis map

表5 游離氨基酸分析Table 5 Analysis of free amino acids

由表5可知，由氨基酸分析儀檢測(cè)，經(jīng)過(guò)最佳工藝條件制備的啤酒廢酵母的酶解液中含有17種游離氨基酸，含量為38.73g/L酶解液。在總氨基酸中，人體所需的8種必需氨基酸（EAA）/總氨基酸（TAA）為44.18%；其中，在Maillard反應(yīng)中對(duì)肉味的產(chǎn)生貢獻(xiàn)較大的谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、蛋氨酸等氨基酸含量較高為35.55%；一些支鏈氨基酸如纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸含量為28.07%，而這些支鏈氨基酸目前被認(rèn)為可以預(yù)防和治療肝腦性疾病[10]。因此，啤酒廢酵母酶解液非常適合作為Maillard反應(yīng)的氨基酸源，不僅可以滿(mǎn)足對(duì)肉味香氣的需求，還兼具較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和較好的保健功效。

3 結(jié)論

通過(guò)各種酶的復(fù)配及酶解實(shí)驗(yàn)，確定酶解效果最優(yōu)的復(fù)配酶組合為酵母抽提酶與β-葡聚糖酶復(fù)合。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)分別考查了溫度、pH值、酶的添加量及復(fù)合酶配比對(duì)酶解啤酒廢酵母酶解效果的影響，并通過(guò)溫度、復(fù)合酶配比及pH值3個(gè)因素對(duì)酶解條件進(jìn)行相應(yīng)面優(yōu)化，結(jié)果，模型的擬合度較好，可靠，得到啤酒廢酵母酶解的最佳工藝條件為：酶解溫度50.32℃，復(fù)合酶配比0.94（酵母抽提酶：β-葡聚糖酶），pH值為5.98，懸浮液濃度10%，NaCl添加量2%，酶解24h。在此條件下，DH模型預(yù)測(cè)值為73.39%，實(shí)測(cè)值為73.84%，實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值十分接近，證明所得回歸模型擬合較好，可以用來(lái)預(yù)測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

所制備的酶解液中游離氨基酸種類(lèi)及含量較為豐富，為38.73g/L酶解液，是進(jìn)行Maillard反應(yīng)制備肉味香精的優(yōu)質(zhì)氨基酸源。

[1]SHARMA Y R,VAUPAREE R B,BHARMAGAR R.Topical glutathione therapy in senile cataracts Cataract III[J].Ind J Ophth,1989,37(3):121-126.

[2]BOROK Z,BUHL R,HUBBARD R C,et al.Effect of glutathione aerosol on oxidant-antioxidant imbalance in idiopathic pulmonary fibrosis[J].Lancet,1991,338(8761):215-216.

[3]陳 軍.從啤酒廢酵母制備酵母抽提物工藝的研究[J].廣西輕工業(yè)，2011（4）：46-47.

[4]吳鑫穎，邱樹(shù)毅，劉文龍.利用啤酒廢酵母進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)型酵母調(diào)味品的研究[J].貴州工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2002，31（3）：77-82.

[5]顧國(guó)賢.新世紀(jì)中國(guó)啤酒工業(yè)發(fā)展展望[J].釀酒科技，2004（4）：28-30.

[6]張 霽，王俊杰.利用啤酒廢酵母制備酵母抽提物的試驗(yàn)研究[J].中國(guó)釀造，2008（15）：75-77.

[7]LEE S K,PARK K H,PEK U H,et al.Production of brewer’s yeast extract by enzymatic method[J].Kor J Appl Microbiol Biot,1993,21(3):276-280.

[8]孫君社.酶與酶工程及其應(yīng)用[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2006.

[9]黃曉鈺，劉鄰渭.食品化學(xué)與分析綜合實(shí)驗(yàn)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2009.

[10]檀志芬，生慶海，邱泉若，等.蛋白質(zhì)水解度的測(cè)定方法[J].食品工業(yè)科技，2005（7）：174-175.

[11]玄國(guó)東.大米蛋白酶法改性及酶解物功能特性研究[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2005，20（3）：1-5.