不同乳酸菌配方對酸奶品質的影響

許 謙

（菏澤學院 生命科學系，山東 菏澤 274000）

酸奶又稱酸乳，是以牛奶為主要原料，經乳酸菌發酵而制成的一種營養豐富、風味獨特、國際流行的保健飲料[1]。乳酸菌是能利用葡萄糖（或可利用的碳水化合物）發酵產生大量乳酸的一群細菌[2]。根據乳酸菌對葡萄糖的發酵方式，可將乳酸菌分為異型發酵和同型發酵兩群。在異型發酵中，葡萄糖被發酵成乳酸、乙酸（乙醇）、CO2；在同型發酵中葡萄糖的發酵終產物絕大多數是乳酸[3]。乳酸菌可定植于人和動物的器官中（如口腔、腸道、陰道等），使得乳酸菌與人類的健康密切相關。乳酸菌的有益作用包括：乳酸菌對腸道菌群的調節作用，乳酸菌的營養及代謝作用，乳酸菌的抗菌作用，乳酸菌脫除真菌毒素的作用，乳酸菌對某些疾病的治療作用及對癌癥的預防作用[4-5]。

常用于酸奶發酵劑的乳酸菌主要包括乳桿菌屬、鏈球菌屬、雙歧桿菌屬等。乳桿菌屬細胞形態多樣，成細長桿狀、短桿狀，一般形成鏈；一般不運動，運動則有周生鞭毛。無芽孢，革蘭氏染色陽性；微好氧，化能異養型，如保加利亞乳桿菌，能利用葡萄糖、果糖、乳糖進行同型乳酸發酵產生適口性差的D-型乳酸。不能利用蔗糖，是產酸能力最強的乳酸菌菌種[6]。鏈球菌是指那些常成鏈狀排列、兼性厭氧的革蘭氏陽性球菌，能發酵葡萄糖產生乳酸的細菌。一般不運動，化能異養型，如嗜熱鏈球菌能利用乳糖進行同型乳酸發酵產生適口性好的L-型乳酸[7]。雙歧桿菌的細胞呈現多種形態。不運動，化能異養型，專性厭氧[8]。

酸奶主要使用嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌為發酵劑。除了這種傳統發酵劑之外，越來越多的試驗揭示了益生菌對健康的有益作用，由于酸奶是攝入益生菌的良好載體，因此在酸奶發酵過程中還會加入各種益生菌，如雙歧桿菌，嗜酸乳桿菌等。

本實驗通過在合適的分離培養基中從酸奶分離出保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、和雙歧桿菌，反復劃線進行純化后鏡檢并用生理生化試驗進行鑒定，而得到純菌種。以嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌與雙歧桿菌的純菌種制成發酵劑，稀釋涂布平板測得3種發酵劑的菌數，并根據其配成不同比例接種到10%脫脂乳液，在43℃恒溫培養。通過測定在不同發酵時間的酸度，對酸奶進行感官品質的檢查，從而找出最佳的乳酸菌配方。

1 材料與方法

1.1 原料

蒙牛冠益乳。

1.2 試劑、儀器

1.2.1 試劑

結晶紫染色液、碘液、95%vol乙醇、番紅、75%vol乙醇、香柏油、95%vol乙醇、香柏油、10%NaOH溶液、0.9%生理鹽水、焦性沒食子酸、質量分數為10%的脫脂乳液、改良TJA培養基、TPY培養基。

1.2.2 儀器

電子天平、電熱鼓風干燥箱、單人單面紫外線誘變臺、美的多功能電磁爐、MLS-3780高壓蒸汽滅菌器、BL-100G型立式壓力蒸汽滅菌器、精密酸度計、YQX-2J型厭氧培養箱、接種環、試管、標簽、記號筆、500mL錐形瓶、250mL錐形瓶、150mL錐形瓶、、厭氧罐、恒溫水浴鍋、堿式滴定管、培養箱、冰箱、、藥匙、光學顯微鏡、擦鏡紙、電爐、石棉網、玻璃涂棒、吸管、棉塞、線繩、pH試紙、500mL量筒、250mL量筒、100mL量筒、培養皿、漏斗、500mL燒杯、250mL燒杯、酒精燈。

1.3 方法

1.3.1 改良TJA培養基的制備（用于分離嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌）

配方：番茄汁50mL，酵母抽提液5g，牛肉膏10g，乳糖20g，葡萄糖2g，K2HPO42g，吐溫80 1mL，乙酸鈉5g，瓊脂15，加水至1000mL；pH 6.8±0.2。

制法：將上述成分加入蒸餾水，加熱溶解，定容，校正pH 6.8±0.2，分裝三角燒瓶，121℃高壓蒸汽滅菌20min。

1.3.2 TPY培養基的制備（用于分離雙歧桿菌）

配方：蛋白胨15.0g，酵母粉2.0g，葡萄糖20.0g，可溶性淀粉0.5g，氯化鈉5.0g，5%半胱氨酸10.0mL，西紅柿浸出液400.0mL；吐溫80 1.0mL；肝提取液80.0mL；瓊脂20.0g；蒸餾水520.0mL；pH 7.0。

制法：西紅柿浸出液的制備：將新鮮的西紅柿洗凈、稱量、切碎后，加等量蒸餾水在100℃水浴中邊加熱邊攪拌約90min然后用紗布過濾，校正pH 7.0，分裝三角燒瓶，115℃高壓滅菌15min。

肝提取液的制備：稱取新鮮豬肝1000g，切碎加蒸餾水至2000mL并混勻放在冰箱中過夜。第2d煮沸15min～20min后用紗布過濾，收集全部濾液，加水補足原量。分裝三角瓶，115℃高壓滅菌15min。

將上述成分加入1000mL蒸餾水中，加熱溶解，調節pH值，分裝三角燒瓶后115℃高壓滅菌15min～20min。

1.3.3 各菌種分離（稀釋涂布平板法）

（1）倒平板：將改良TJA培養基、TPY培養基加熱融化后，冷卻至55℃～60℃時倒平板，每種培養基倒6皿。

（2）編號：取7無菌試管，依次編號為10-1，10-2，10-3，……10-7；再取18套無菌培養皿，依次編號為10-6、10-7，各稀釋梯度作三個重復。

（3）制備酸奶稀釋液：取1mL酸奶于9mL無菌生理鹽水，充分混合使細胞分散，制成10-1稀釋液。再用一支1mL無菌吸管吸取1mL上述稀釋液于盛有9mL滅菌生理鹽水的編號10-2的試管內，以此類推制成10-3，10-4……10-7稀釋液。

（4）取樣：1mL無菌吸管吸取10-6，10-7稀釋液0.1mL于相應編號的培養皿中間。

（5）涂布：用無菌玻璃涂棒在培養基表面輕輕的涂布均勻。

（6）培養：將平板置于厭氧罐在42℃培養48h。

（7）挑菌落：將長出的單菌落進行鏡檢，若發現有雜菌，須再次進行分離純化，直到獲得純培養。培養后長出的單菌落挑取少數菌苔接種在相應培養基的斜面上進行菌種保藏。

1.3.4 菌種鑒定

將分離純化的菌種進行革蘭氏染色，確定是否分離了純菌種。

1.3.5 酸奶制作

（1）質量分數為10%脫脂乳液的制備：在3個500mL的錐形瓶中，分別稱取30g脫脂奶粉于270mL蒸餾水中，配成10%的脫脂乳液。在14個150mL錐形瓶中，分別取15g脫脂奶粉于135mL蒸餾水中，配成10%的脫脂乳液。將其在高壓蒸汽鍋內105℃滅菌15min。

（2）發酵劑的制作：將分離得到的嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌和雙歧桿菌按3%的接種量分別接種于3個裝有滅菌脫脂乳的錐形瓶中，用保鮮膜密封好后置于42℃的恒溫培養箱中培養。

（3）發酵劑的菌種計數：用稀釋涂布平板法進行菌落計數。將發酵劑樣品按十進制稀釋后，取10-5、10-6兩個稀釋度0.1mL于相應的選擇培養基并用無菌玻璃涂布棒進行涂布。將平板置于厭氧罐在42℃培養48h。每個稀釋度作3個重復。選擇菌落數在30～300的平板進行菌落計數。從而得到3種發酵劑的菌種數量。

（4）14種乳酸菌配方的制成：在超凈工作臺，根據3種發酵劑的菌種數量，搖勻發酵劑，取其相應的體積制成14種乳酸菌配方接種到14個裝有滅菌脫脂乳的錐形瓶中，并編號。14種乳酸菌配方見表1，配制14種乳酸菌配方所吸取的3種發酵劑體積見表2。

（5）發酵：將14個錐形瓶用保鮮膜密封好，充分搖勻后放入42℃恒溫培養箱中培養。每隔40min測定一次的pH值。做出其pH值隨時間變化的曲線。出現凝乳后停止培養。

（6）后酸化：放入4℃冰箱中冷藏12h進行后酸化。

（7）測定質量指標：測定酸奶的感官指標、理化指標（酸度）和微生物指標（大腸菌群數）。

感官指標的測定：檢查酸奶的組織狀況，然后品嘗酸口感，聞其氣味是否有異常。鑒定由5人參加，每項指標滿分以100分計，然后進行加權處理。其中組織狀態35%、酸甜適口性35%、發酵乳香味10%、外觀色澤10%、口感10%，以評分員的平均評分為每份樣品的得分[9]。

表1 14 種乳酸菌配方Table 1 14 LAB formulas

表2 14 種乳酸菌配方所吸取的發酵劑體積Table 2 Culture absorption volumes of 14 LAB formulas mL

酸奶酸度的測定：測定酸奶的滴定酸度用吉爾涅爾度（°T）表示，取10mL酸乳，用20mL蒸餾水稀釋。加入0.5%的中性酚酞指示劑0.5mL，以0.1mol/L NaOH溶液滴定，將所消耗的NaOH毫升數乘以10，即為酸奶的酸度[10]。其他各指標按照乳品的常規檢驗法進行。

酸奶微生物指標的測定：采用GB4789.3平板計數法進行測定。

2 結果與分析

2.1 酸奶中乳酸菌的菌落形態

在改良TJA培養基中，平皿底為黃色，培養基上有2種菌生長。保加利亞乳桿菌菌落微白色，濕潤，菌落較大，直徑（3±1）mm，邊緣不整齊，如棉絮團狀菌落；嗜熱鏈球菌菌落光滑，微白色，濕潤，菌落較小，邊緣整齊。見圖1。

圖1 保加利亞乳桿菌菌落（大）和嗜熱鏈球菌菌落（小）Fig.1 Colonies of L. bulgaricus (large) and S. thermophilus (small)

在TPY培養基中，平皿底為黃色，雙歧桿菌菌落白色，光滑，較小，突起，邊緣整齊，呈奶油色，瓷白色，柔軟，細膩。見圖2。

圖2 雙歧桿菌菌落Fig.2 Bifidobacterium colony

2.2 乳酸菌的鑒定

乳酸菌經革蘭氏染色后均呈藍紫色，為陽性菌。雙歧桿菌的細胞呈現多種形態：有短桿狀形態規則或纖細桿狀具有尖細末端的細胞，也有長而稍彎曲狀的、Y型或V形，見圖3。保加利亞乳桿菌為細長桿狀，見圖4。嗜熱鏈球菌單個球形，呈鏈狀排列，見圖5。

圖3 雙歧桿菌Fig.3 Bifidobacterium spp.

圖4 保加利亞乳桿菌Fig.4 L. bulgaria

圖5 嗜熱鏈球菌Fig.5 S. thermophilus

2.3 三種發酵劑的菌落數

在改良TJA培養基上的保加利亞乳桿菌的平均菌落數為5.6×107cfu/mL，嗜熱鏈球菌的菌落數為1.72×108cfu/mL；在TPY培養基的雙歧桿菌的菌落數為8.8×107cfu/mL。因此3種發酵劑中保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌與雙歧桿菌比例為1:3:1.5。

2.4 不同乳酸菌配方的脫脂乳發酵期間的變化

2.4.1 不同乳酸菌配方的脫脂乳在不同發酵時間的pH值變化

2.4.2 不同乳酸菌配方的脫脂乳pH值隨發酵時間變化的曲線

作1-14號配方脫脂乳的pH值隨時間變化的曲線，見圖6。

表3 不同乳酸菌配方的脫脂乳在不同發酵時間的pH 值Table 3 pH values of skimmed milk inoculated with different LAB formula at different fermentation times

由表3、圖6及觀察記錄得知，1號、2號和3號相比，配方中只有保加利亞乳桿菌時凝乳最快，其次是只有嗜熱鏈球菌的脫脂乳，最后是雙歧桿菌脫脂乳。這是因為雙歧桿菌較保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的營養代謝能力相對較弱，生長速度較慢，因此發酵所需時間比保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的長[11]。在開始階段，保加利亞乳桿菌較嗜熱鏈球菌pH值變化小，發酵速度慢。在大約90min后pH值變化快，發酵速度超過嗜熱鏈球菌。

圖6 不號乳酸菌配方的脫脂乳ph值隨時間變化的曲線Fig.6 pH change with time of skimmed milk inoculated with different LAB formulas

4、5、6號與1、2、3號相比，混合菌比單菌發酵速度快，凝乳快。這是因為嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌有很好的共生關系。當2種菌按一定比例接種于牛乳中進行發酵時，桿菌為球菌提供必需的肽和氨基酸，如亮氨酸組氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、甘氨酸，而后者產生的甲酸和CO2又刺激了前者增殖[12]。

4、5、6號相比，7、8號相比，9、10號相比，可看出混合菌中，傳統乳酸菌發酵劑（保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌）與在其基礎上加入了雙歧桿菌的混合菌不同，pH值變化不同。4號凝乳速度最快，5號，6號較慢。7號較快，8號較慢。9號較快，10號較慢。這是因為傳統乳酸菌發酵劑（保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌）與益生菌（雙歧桿菌）之間存在拮抗作用。雙歧桿菌能產生乳酸、乙酸及細菌素，傳統發酵劑除了會產生乳酸外，還會產生過氧化氫、雙乙酰及細菌素等。這些物質的主要作用是抑制其他有害微生物的生長，但同時也會使傳統乳酸菌發酵劑和益生菌之間相互抑制[11]。5號與6號相比，加入的雙歧桿菌的量不同，其發酵結果也不同，這是因為微生物間拮抗作用的程度不同。

在圖6中，10、11、12號與5、8、13、14相比，5、8、13、14號的發酵速度較快。因保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌之間除了有共生關系之外，其間也存在著拮抗關系。由此可看出，混合菌中，球菌占優勢時發酵速度較快。

2.5 酸奶的質量指標

2.5.1 酸奶的感官指標

酸奶的感官指標見表4。

2.5.2 酸奶的理化指標

測得各配比條件下所生產酸奶的酸度見表5。

2.5.3 酸奶的微生物指標

表4 酸奶的感官指標Table 4 Sensory indexes of yogurt

表5 酸奶的理化指標（酸度）Table 5 Physical and chemical indexes of yogurt (acidity)

測得各配比條件下所生產酸奶的微生物指標大腸菌群數為0cfu/mL，滿足酸奶國家標準要求。

由表4、表5可以看出，采用5號配方，其組織狀態、氣味和口感比其他的配方都好一些，并且酸度適中。因此在本實驗中采用的5號配方是生產酸奶的最佳配方，即保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌與雙歧桿菌的比例為1:1:1。

3 討論

3.1 3種乳酸菌的分離

在冠益乳中，嗜熱鏈球菌占優勢，保加利亞乳桿菌和雙歧桿菌較少，分離較難。采用改良TJA培養基分離保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌，因這2種菌在改良TJA培養基上生長良好，且2種菌的菌落形態不同：保加利亞乳桿菌菌落微白色，濕潤，菌落較大，直徑（3±1）mm，邊緣不整齊，如棉絮團狀菌落；嗜熱鏈球菌菌落光滑，微白色，濕潤，菌落較小，邊緣整齊。雙歧桿菌是專性厭氧菌，對環境要求和營養要求嚴格，采用TPY培養基能很好地分離出雙歧桿菌。

3.2 不同乳酸菌配方對酸奶品質的影響

在酸奶發酵中，保加利亞乳桿菌凝乳最快，其次是嗜熱鏈球菌，雙歧桿菌最慢。

采用混合菌配方發酵酸奶的速度和口味等都優于單菌種配方發酵的酸奶。

在傳統乳酸菌發酵劑的基礎上加入了雙歧桿菌的配方發酵的酸奶的口味和營養優于傳統乳酸菌發酵劑發酵的酸奶。加入雙歧桿菌的量不同，其口味稍有差別。

傳統發酵劑中不同的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌配方，其所發酵的酸奶的口味也不同。嗜熱鏈球菌占優勢的配方所發酵的酸奶的口味較好。因保加利亞乳桿菌是產酸能力最強的乳酸菌菌種[11]，若保加利亞乳桿菌占優勢，則生產的酸奶酸度太大。

經過綜合分析可知，在保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌與雙歧桿菌的比例為1:1:1時更有利于形成風味較好的酸奶。

[1]金世琳.乳酸菌的科學與技術[J].中國乳品工業，1998，26（2）：14-16.

[2]沈 萍.微生物學實驗[M].北京：高等教育出版社，2000.

[3]JOVITA MR,COLLINS MD,SJODEN B,et al.Characterization of a novel Atopobium isolate from the human vagina:description ofAtopobiumvaginaesp.Nov[J].Int J Syst Bacteriol,1999,49:1573-1576.

[4]COSTERTON J W,CHENG K J,GEESEY G G,et al.Bacterial biofilmsin nature and disease[J].Ann Rev Microbiol,1987,41:435-464.

[5]吳憲忠，趙 輝，吳國峰.乳酸菌在酸奶中的應用及研究進展[J].中國釀造，2007（1）：1-3.

[6]ANALIA G A,DE ANTONI G L,ANON M C.Proteolytic activity ofLactobacillus bulgaricusgrown in milk[J].J Dairy Sci,1993,76:1498-1505.

[7]范麗平，劉 飛，霍貴成.嗜熱鏈球菌胞外多糖的結構生物合成與遺傳調控[J].中國乳品工業，2005，33（11）：42-45.

[8]BIAVATI B,MATTARELLI P,CROCIANI F.Bifidobacterium saeculare:a new species isolated from faeces of rabbit[J].Syst Appl Microbiol,1991,14:389-392.

[9]姜竹茂，尹吉增，賀紅軍，王友湘低聚木糖在保健酸奶中的應用[J].中國乳品工業，2005，33（11）：11-13.

[10]孔保華.乳品科學與技術[M].北京：科學出版社，2004.

[11]謝繼志.影響酸奶質量的因素及其品質控制[J].中國乳業，2001（1）：15-17.

[12]趙 征，胡道靜.菌種比例對酸奶的風味及貨架期的影響[J].食品加工，2004（3）：54-56.