酒曲中一株不產毒黃曲霉的分離與鑒定

惠 明，尚小利，田 青，張開平

（河南工業大學 生物工程學院，河南 鄭州 450001）

黃曲霉（Aspergillus flavus）在自然界分布十分廣泛，用其制曲來釀造黃酒、豆醬等在中國、日本具有悠久的歷史[1]。黃曲霉群微生物包括黃曲霉、米曲霉及寄生曲霉等，部分株系在一定條件下產生黃曲霉毒素，對人和動物具有很強的致癌作用，但有些株系不產毒素（如蘇-16、AS 3.800、A.flavusYA4.9等），并且能產生豐富的液化型淀粉酶和蛋白酶，用于麥曲、米曲制作中起糖化、蛋白分解等作用[2-3]。“以麥制曲，用曲釀酒”是中國黃酒的特色，制曲質量的好壞在黃酒釀造中具有極其重要的地位[4]。黃酒界有以黃曲霉制曲，因其曲種苦澀味較輕，釀酒品質好、風味獨特，但糖化酶活力低，因此分離和篩選高糖化酶活力的黃曲霉菌株已成為黃酒業當務之急。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

樣品：鎮平五朵山大曲、香花鎮散曲、安徽雙輪白酒曲、鎮平大曲、米曲、丹溪紅曲米、蘇州甜酒藥等；原料：馬鈴薯、麩皮、玉米粉，市售。

1.1.2 試劑

蛋白胨、葡萄糖、牛肉膏、瓊脂粉、可溶性淀粉生化試劑：由北京奧博星生物技術責任有限公司提供；氯化鈉、脫氧膽酸鈉鹽、酒石酸鉀鈉、硫酸亞鐵、3，5-二硝基水楊酸等（分析純試劑）：由天津科密歐化學試劑開發中心提供。

1.1.3 培養基

（1）PDA培養基[5]：取新鮮馬鈴薯，去皮后稱取200g，加入1000mL水，煮沸20min后，用4層紗布過濾，清液中加入20g葡萄糖和20g瓊脂，煮沸，補足失水。121℃滅菌20min；（2）透明圈培養基[6-7]：可溶性淀粉4g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，牛肉膏3g，脫氧膽酸鈉lg，瓊脂20g，水1000mL，pH7.2，121℃滅菌15min；（3）孟加拉紅培養基：蛋白胨5g，葡萄糖10g，磷酸二氫鈉1g，硫酸鎂0.5g，1:3000孟加拉紅100mL，氯霉素0.1g，脫氧膽酸鈉1g，瓊脂粉20g，pH6.5，水1000mL，121℃滅菌15min；（4）麩皮培養基：稱取新鮮麩皮10g，加水12mL充分拌勻，潤料30min后，裝于250mL三角瓶中，塞好棉塞，121℃高壓滅菌30min，取出搖瓶打散。

1.1.4 主要儀器

HZQ-Q 全溫振蕩器（哈爾濱東聯電子有限公司），UV-1100 紫外/可見分光光度計（上海美譜達），PYX-DHS-40型恒溫培養箱（上海躍進），YS 100 攝像顯微鏡（日本NiKon），GZX-GF-MBS-1型干燥箱（上海躍進），JSM-6390LV型掃描電子顯微鏡（日本電子株式會社）等。

1.2 方法

1.2.1 分離方法

稱取各酒曲樣品1.0g，在無菌條件下分別加入裝有99mL的無菌生理鹽水和若干玻璃珠的三角瓶中，振蕩處理24h，經無菌脫脂棉過濾后得到菌懸液，分別稀釋到10-4、10-5、10-6梯度，分別吸取100μL菌懸液涂布到孟加拉紅培養基上，置30℃恒溫培養3d～5d，觀察菌落生長情況。

挑取生長良好的疑似黃曲霉菌株，接種于透明圈培養基上，30℃培養3d，長出菌落后，滴加碘液，選擇K值（透明圈直徑D與菌落直徑d的比值）大的作為初篩菌株。將初篩菌株接種于PDA培養基上進行純化，復篩，挑取平均K值較大的菌株接種于PDA斜面上，保藏備用。

1.2.2 菌株鑒定

（1）形態觀察：將保存于斜面上的疑似黃曲霉菌株接種在平板上，觀察菌落形態，并在光學顯微鏡和電鏡下觀察菌株的菌絲、頂囊和孢子的形態，查閱相關資料[8]進行菌株鑒定。

（2）分子鑒定：特異性基因（ITS）序列由上海生工測定。

1.2.3 產毒分析

將斜面菌種活化后，用無菌生理鹽水洗下孢子并打散，制備孢子懸浮液，取0.5mL接種麩皮培養基中，28℃恒溫培養40h～48h，菌絲長滿培養基表面，間歇振蕩，防止結塊，繼續培養至72h。種曲成熟后，倒入己消毒過的牛皮紙袋內，搓散后放入干燥箱內40℃通風干燥12h，即得純種干曲。

取1g干曲加入9mL蒸餾水，在40℃水浴條件下間斷攪拌浸提1h，3000r/min離心5min得上清液試樣，送至農業部農產品質量監督檢測中心（鄭州）進行黃曲霉毒素B1含量的檢測評估，方法參考GB/T 5009.22-2003[9]。

1.2.4 產糖化酶性能

孢子懸浮液的制備：將保藏在斜面上的菌株活化后，用無菌生理鹽水孢子洗下并打散，血球計數板計數后，將孢子濃度稀釋至1×106個/mL。

標準曲線的制作：3，5-二硝基水楊酸比色定糖法[10]。取7支試管，編號，按既定量精確加入葡萄糖標準液和3，5-二硝基水楊酸試劑，將各試管溶液混合均勻。沸水浴中加熱5min，取出后立即放入盛有冷水的燒杯中冷卻至室溫，再向每管中加入適量蒸餾水，搖勻。在波長520nm處測吸光度值，以吸光度值為縱坐標，以葡萄糖（mg）為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程Y=0.5209X-0.0128（R2為0.9969）。

粗酶液的制備：稱取固體曲1g，加入19mL蒸餾水，40℃浸提1h，用脫脂棉過濾，得粗酶液。

糖化酶活力的測定：參照糖化酶GB/T 8276-2002。定義：1g 曲在40℃、pH 4.6 條件下，1h水解可溶性淀粉生成1mg葡萄糖的酶量為1個酶活力單位。

2 結果與討論

2.1 目標菌株的分離及形態觀察

利用孟加拉紅選擇性培養基，從8個酒曲樣品中分離得到78株曲霉菌，通過點種淀粉培養基進行產糖化酶能力復篩（透明圈法），確定11株產糖化酶能力較強的菌株。對其中一株糖化酶高產株（編號：D-57）進行了形態觀察（見圖1）和分子檢測。

菌株D-57生長較快，菌落初呈絨狀，亮黃綠色，比較平坦，后中心微隆，慢慢變為暗綠色，菌落表面呈顆粒狀，有放射性同心環形。光學顯微鏡下觀察菌株形態：菌絲無隔，頂囊呈橢圓形，頂囊表面雙層小梗，分生孢子呈光滑球形。用掃描電鏡觀察發現黃曲霉分生孢子表面有不規則的突起、球形、粗糙，菌絲無隔，頂囊膨大成球形，雙層小梗呈放射的掃帚狀。

圖1 黃曲霉D-57菌株的分離及形態觀察Fig.1 Isolation and morphology of strain Aspergillus flavus D-57

2.2 D-57菌株的基因序列分析

測定菌株D-57的ITS序列（539bp）如下：CCTCCTCCCACCCGTGTTTACTGTACCTTAGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCATTCATGGCCGCCGGGGGCTCT CAGCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGGAGACACCACGAACTCTGTCTGATCTAGTGAAGTCTGAGTTGATTGTATCGCAATCAGTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAGTGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCATCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGTCGTCGTCCCCTCTCCGGGGGGGACGGGCCCCAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGATCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCTGTAGGCCCGGCCGGCGCTTGCCGAACGCAAATCAATCTTTTTCCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAATCGGAGG

經GenBank（登記號：JN050281）比照，用clustal軟件做系統發育樹圖：

圖2 D-57菌株的系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of the strain D-57

經Clustal軟件分析，判定該菌株為子囊菌門，絲孢菌綱，叢梗孢目，叢梗孢科，曲霉屬，黃曲霉。

2.3 產毒分析

利用黃曲霉D-57菌株接種麩皮培養基，試制純種麩曲，樣品送往農業部農產品質量監督檢驗測試中心（鄭州）進行黃曲霉毒素B1含量的測定，依據GB/T 5009.22-2003方法檢測，樣品中黃曲霉毒素B1含量小于5μg/kg（檢驗報告No.2011-0658）。根據我國糧食、豆類及發酵食品中黃曲霉毒素B1允許量標準（GB2761-81）規定為≤5μg/kg，因此可以認為篩選得到的黃曲霉D-57菌株為安全菌株。

2.4 黃曲霉D-57產糖化酶能力分析

在麩皮培養基上，初步探討了黃曲霉D-57產糖化酶的條件。試驗表明培養溫度、時間、添加玉米粉濃度等都對產糖化酶具有顯著影響，其中在培養溫度32℃、時間3d、添加玉米粉含量4%（w/w），產糖化酶活力（糖化力）較高，可達1015.3mg/（h·g），具有潛在的生產應用價值。

3 結論

利用孟加拉紅選擇性培養基，從收集到的8種傳統酒曲樣品中分離出70余株曲霉菌，通過透明圈水解試驗（淀粉培養基）進行復篩，確定11株目標菌株。對其中一株水解圈較大的菌株（命名D-57）進一步分離純化和菌種鑒定。

D-57菌株在PDA培養基上生長較快，菌落表面呈顆粒狀，有放射性同心環，初期呈絨毛狀，逐漸變亮黃綠色，再到暗綠色。光學顯微鏡下觀察菌絲無隔，頂囊呈橢圓形，頂囊表面有雙層小梗，分生孢子呈光滑球形，用掃描電鏡（SEM）觀察發現分生孢子表面有不規則的突起、球形、粗糙；分析了D-57菌株的ITS序列并結合Clustal軟件分析，認為D-57菌株為子囊菌門，絲孢菌綱，叢梗孢目，叢梗孢科，曲霉屬，黃曲霉。

通過制麩曲檢測，黃曲霉菌株D-57不產黃曲霉毒素，屬于安全菌株；對其產糖化酶的能力進行測試可知：在添加玉米粉4%（w/w）的麩皮培養基上，32℃培養3d，麩曲糖化酶活力可達1015.3mg/（h·g）。

[1]顧國賢.釀造酒工藝學[M].北京：中國輕工業出版社，1996.

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