肢體缺血再灌注損傷機制與防治研究進展

黃瑞峰，丁 明

缺血的組織或器官恢復血供后出現一系列的并發癥稱為缺血再灌注（IR）損傷，包括兩方面的內容：①原發病變損傷的擴大；②原發病變遠處的器官和組織發生繼發性的損傷。臨床上缺血再灌注損傷與斷肢再植的成功率密切相關。如何保存離斷肢體并延長再植的時限，更好地恢復再植后的肢體功能，仍是臨床上有待解決的問題。斷肢缺血損傷和再植后再灌注損傷是一個連續的過程，但缺血損傷和再灌注損傷本質上是兩個不同的過程，研究斷肢保護是再植的基礎，研究再灌注損傷是斷肢保護的延續，兩者不可分離。近年來對肢體缺血再灌注損傷的機制研究取得了很大成就，同時對其防治的研究也有了長足進步。現綜述如下。

1 肢體缺血再灌注損傷發生的機制

Pack等[1]強調，缺血再灌注損傷發生的最根本的機制是氧自由基的大量產生和離子泵功能障礙造成細胞內鈣超載以及隨之而來的微血管功能障礙。IR時，Ca2+大量內流，激活鈣依賴磷脂酶，降解生物膜磷脂，導致膜損害，脂質過氧化以及破壞細胞骨架并引發中性粒細胞（polymorphonuclear neutrophil，PMN）的激活和浸潤，通過呼吸爆發釋放大量的氧自由基（與鈣離子激活鈣依賴蛋白酶，催化黃嘌呤脫氫酶轉變為黃嘌嶺氧化酶有關）、蛋白水解酶及炎癥介質引發或加重細胞損傷。大量自由基的存在可氧化生物膜上的不飽和脂肪酸，使得膜流動性下降并且通透性增加，造成細胞水腫；攻擊生物大分子物質，造成多種酶和核酸功能異常；對血小板和粒細胞有趨化作用，造成微循環障礙；損壞細胞器的膜結構（如溶酶體、線粒體等）；損傷DNA和線粒體，誘發細胞凋亡。在這些因素綜合作用下，在微血管內PMN和內皮細胞相互粘附的作用明顯增加，其結果是造成微血管功能障礙并滅活一氧化氮（NO）。研究發現核因kB（NF-κB）可高效誘導多種細胞因子 （如 TNF-a 和 IL-2、I）、IL-6、IL-8） 和黏附分子（如 ICAM-1、ECAM-1和 VCAM-1） 及趨化因子 （如 C3、COX-2）等的基因表達。NF-κB作為炎癥調控的樞紐和關鍵，適當干預其活化具有一定的臨床應用價值[2，3]。

2 肢體缺血再灌注損傷時骨骼肌細胞凋亡的基礎

細胞死亡形式包括多種，已知的有壞死、凋亡和有絲分裂細胞死亡（指經過有絲分裂的死亡方式，與細胞分裂過程中受阻有關）。細胞凋亡是由基因調控的，是維持機體內環境穩態、適應內外環境的變化、維持正常生長發育生理功能的自主性死亡，是清除無功能甚至有害細胞所必須的。細胞凋亡過程是以DNA片段分化裂解為特征的耗能過程，有賴于mRNA和蛋白質的新合成。在肢體缺血再灌注損傷發生時，細胞不至于發生壞死但又恢復無望，于是選擇了凋亡。缺血再灌注損傷引起的細胞凋亡與氧自由基大量產生、鈣超載、線粒體通透性轉換孔道（mPTP）開放、NO的減少和鉀通道阻滯有關[4]。哺乳動物細胞凋亡途徑有二，內源性通路即線粒體途徑和外源性通路即通過激活細胞膜FAS受體途徑。細胞凋亡的線粒體通路被Bcl-2蛋白家族類所調控[5]。Bcl-2蛋白家族類中的凋亡前蛋白導致線粒體外膜透化釋放一些細胞凋亡激活因子到細胞質中，包括細胞色素C，SMAC，核酸內切酶G，凋亡誘導因子（AIF）[6]，其中最主要的是細胞色素C，細胞色素C釋放后激活一系列級聯反應最終導致細胞凋亡。細胞色素C與Apaf-1在ATP/dATP存在下發生構象變化形成復合體，稱為凋亡體，凋亡體吸引Caspase-9前體，Caspase-9前體聚合后被反式催化激活，活化的Caspase-9繼而作用于下游的 Caspase（包括 Caspase-3，Caspase-6，Caspase-7）引起細胞凋亡。

Bcl-2蛋白家族類可以在細胞凋亡期間調節線粒體功能，這個蛋白家族的凋亡前體蛋白和抗凋亡蛋白可以通過與線粒體相互作用來控制線粒體外膜的完整性[7]。基于Bcl-2的同源性結構域（BH1-4結構域），Bcl-2蛋白家族可以分為三個亞型：①抗凋亡蛋白：包括 Bcl-2，Bcl-xL，Bcl-w，Mcl-1和 A1，含有BH1-4結構域；②凋亡前體蛋白：包括Bax，Bak和Bok，含有BH1-3結構域；凋亡前體蛋白Bak通常定位于線粒體外膜，Bax在受到凋亡刺激后從細胞質轉移到線粒體外膜，插入外膜導致其構象變化和蛋白脂質孔成型，進而導致線粒體外膜透化；③BH3-only凋亡前體蛋白：包括Bid，Bim，Bad，Bik，Bmf，Hrk，Noxa 和 Puma，在不同細胞凋亡信號中發揮最初傳感器的作用；BH3-only蛋白類被稱作是直接激活子（direct activators），包括 Bid，Bim，和 Puma，既可以抑制促存活蛋白類的功能，又能直接與Bax和Bak結合導致二者構象變化從而被激活[8]。經大量實驗研究發現，Bcl-2可通過抑制鈣離子釋放，抑制氧自由基的生成，維持線粒體膜穩定性及阻止促凋亡基因信號傳導等多個方面發揮抗凋亡作用。而Bax作用與Bcl-2恰好相反，Bax蛋白可與Bcl-2蛋白結合形成異二聚體，使得Bcl-2蛋白失活而加速細胞凋亡的發生。Bcl-2與Bax的表達比值是決定細胞是否走向凋亡的關鍵。當Bcl-2表達增高時，與Bax形成異源二聚體使Bax失活，抑制凋亡發生；當Bax表達增高時，被磷酸化的Bcl-2與Bad相結合，這樣Bax就從異源二聚體中釋放出來，游離的Bax相互之間就可以形成誘導細胞死亡的同源二聚體，當這些胞質內的Bax同源二聚體易位到線粒體后就會打開線粒體內膜和外膜上的滲透轉運孔（mPTP），進而導致Cytc及Apaf-1（凋亡誘導基因）釋放入胞漿，啟動Caspase酶系級聯反應和促進蛋白質水解從而導致細胞凋亡的發生。mPTP是位于線粒體內膜的一個非特異性通道，允許<1.5 kDa的分子通過[9]。生理條件下mPTP是關閉的，在缺血再灌注損傷和細胞毒性等損傷性刺激時開放。mPTP不可逆開放廢除了線粒體的跨膜電位，導致ATP生成減少。研究表明mPTP于再灌注后5～10 min開放，而不是在缺血期[10]。Baines等[11]的研究證實了mPTP開放導致細胞凋亡，在大鼠模型凋亡的心肌細胞中發現親環素D增多。正常生理條件下，親環素D的增多導致mPTP開放釋放細胞色素C引起細胞凋亡。缺血再灌注導致mPTP開放有多種因素，其中包括：線粒體內鈣超載，腺嘌呤核苷酸移位酶，與親環素D結合以及無機磷酸鹽水平。有研究證實mPTP抑制劑（環胞素A）和Cyp-D的遺傳缺失可以顯著減少心肌梗死發生時的梗死面積[12]。mPTP的通道部分的分子結構還沒有被證明，但腺嘌呤核苷酸移位酶，親環素D以及無機磷酸鹽被認為是mPTP重要的調節成分。親環素D結合ANT使mPTP對鈣離子敏感從而促進mPTP開放，而無機磷酸鹽是一種mPTP開放的抑制劑[9]。mPTP的開放可能是短暫的，可逆的，以應對那些比較弱的損傷，這并不導致ATP耗竭。但一旦發生，可能引起足量的細胞色素C釋放，引起細胞凋亡。研究證明如果缺血時間較長，程度較重，造成mPTP廣泛持續的開放，細胞此時僅僅依靠糖酵解供應能量，很快細胞內ATP耗盡，細胞的代謝內環境被破壞，此時細胞產生不可逆的損傷，稱為細胞壞死。如果缺血時間較短或者程度較輕，再灌注后ATP能得到及時的補充從而部分或者完全恢復，細胞壞死則可能避免，但是此時mPTP仍會開放而導致細胞色素C釋放，繼而引起一系列反應導致細胞凋亡。

3 骨骼肌缺血再灌注損傷的防治

肢體缺血再灌注損傷不僅影響到缺血組織的成活和以后的功能恢復，而且還可能會累及遠隔器官，嚴重者可引起多器官功能衰竭綜合征而導致患者死亡。積極防治肢體缺血再灌注損傷，以防再灌注損傷擴大化，是一直以來研究的重點。現將近幾年的治療方法做簡單歸納。

3.1 盡量縮短缺血時間 臨床試驗和動物實驗觀察到缺血再灌注損傷程度與缺血持續時間密切相關。下肢出血止血帶時間應嚴格控制在2 h以內，上肢止血帶時間不宜超過1.5 h，超過時限后，缺血時間越長，損傷范圍越大且損傷程度越重，甚至可能進入不可逆損傷期[13]。邢新等在研究缺血再灌注損傷時對骨骼肌血管影響中證實兔肢體缺血5 h，再灌注時骨骼肌微血管內皮細胞顯著腫脹，基底膜斷裂，細胞間質高度水腫，最終導致大部分肌纖維壞死。因此盡快盡早的消除缺血原因，恢復血流灌注是減輕和防止缺血再灌注損傷的最基本和最重要的措施。

3.2 缺血預處理 缺血預處理指經歷短暫缺血以后的組織器官可以延緩和減輕隨后較長時間內的缺血再灌注所造成的損傷。這一概念自1986年由Murry首次提出后引起極大關注[14]。此后，大量實驗研究從細胞、器官水平探討預處理的保護機制，并證明缺氧預處理是一種內源性保護機制[15]。對肢體事先進行10 min缺血隨后再灌注10 min，重復3次，能顯著減輕隨后長時間缺血所致的再灌注損傷。Lorenz等[16]發現3次預處理與1次、2次預處理相比，骨骼肌的收縮力、耐受力和肌力均有顯著提高，從而提出預處理的功效依賴于預處理的次數。缺血預處理可釋放多種內源性活性物質，表現為早期保護（數分鐘內出血，持續2～4 h）和延遲保護（24 h出現，持續72 h）。其中蛋白激酶C（PKC）、腺苷、緩激肽、前列腺素、一氧化氮、降鈣素基因相關肽等可能與早期保護有關，可能與腺苷受體激活后通過信號轉導促進細胞內腺苷合成，增加能量儲備及抑制粒細胞粘附等有關；延遲保護可能與熱休克蛋白 70（HS70）、超氧化物歧化酶（SOD）、腺苷、一氧化氮及開發細胞膜上的通道等有關。現藥物的預處理可模擬物理預處理發揮保護作用，如尼克地爾等能顯著減輕骨骼肌的缺血再灌注損傷。馮亞高等[17]實驗證實3-硝基丙酸預處理可顯著保護骨骼肌缺血再灌注損傷。3-硝基丙酸是琥珀酸脫氫酶抑制劑，能不可逆的抑制琥珀酸脫氫酶，使得線粒體氧化磷酸化偶聯受阻，ATP生成減少，以此來模擬缺血預處理。經3-硝基丙酸預處理后氧自由基生產減少，骨骼肌過氧化損傷減輕，組織中中性粒細胞聚集減輕，細胞膜穩定性加強，但其具體的保護機制尚未十分清楚。

3.3 低壓低流低溫再灌注 低壓低流條件下實現再灌注可使恢復灌注的氧供不至于于突然增加而引發大量氧自由基的形成。缺血再灌注損傷對低溫比較敏感，李靖年等[18]研究發現10～15℃低溫對組織保護作用較好，低于5℃容易產生較大的生理擾亂，并對局部組織有一定程度的損傷。其保護機制可能是低溫再灌注使缺血器官代謝降低、氧耗減少、氧自由基生成減少、代謝產物聚集減少；低溫還可以減少白細胞粘附，降低炎癥反應的發生。Thorlacious等[19]的研究表明大鼠的體表體溫降至8℃，持續30 min，動脈管徑明顯變小，而靜脈和毛細血管管徑不變。低溫可以顯著減少血流量和功能性毛細血管的密度。

3.4 控制再灌注條件 在恢復系統血流前，調整再灌注液的組成成分和物理狀態能有效減輕缺血再灌注損傷。Ihnken等[20]用動物模型模擬臨床下肢血栓形成模型，在血栓的兩端分別插入導管，連接于滾動泵上，并通過該泵控制血流的成分和速度，用一種復合的再灌注液與血液按1∶6的比例混合，在 37 ℃，灌注壓不超過 50 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）條件下，經滾動泵將調整好的灌注液灌注30 min后恢復系統血流能明顯減輕缺血再灌注損傷。再灌注液的主要成分如下：10%葡萄糖、谷氨酸和天冬氨酸作為代謝底物，別嘌呤醇可清除氧自由基，檸檬酸葡萄糖用于減輕鈣超載，Thromethamine液用做pH緩沖液。Beyersdorf等[21]證明：灌注壓50 mmHg，37℃，富含谷氨酸和天冬氨酸、高滲、堿性、低鈣的再灌注液，在恢復血流前再灌注20 min，可使缺血肢體骨骼肌的收縮功能立即恢復。控制性再灌注在臨床上已成功應用于移植和血管栓塞的治療。

3.5 筋膜切開及部分肌肉切除術 肢體嚴重的缺血再灌注損傷可引起組織嚴重水腫，組織內壓力升高，導致骨筋膜室綜合征，增加了肌肉壞死感染和有毒害因子進入血液引起全身炎癥反應的風險。筋膜切開可有效減輕組織內壓力，同樣部分功能次要肌肉的切除也可減輕組織壓力，減少毒素吸收，預防全身并發癥的發生。

3.6 高壓氧治療 缺血的特點是缺氧，利用高壓氧增加組織對氧氣的利用，以減輕缺血再灌注損傷。其機制包括：①高壓氧可使血中氧張力、血氧含量和組織氧儲備顯著增加，迅速提高受損組織內的氧含量，并增加氧在組織中的彌散半徑，從而可有效改善缺氧狀態，恢復組織細胞代謝功能；②高壓氧作用下，微血管和細胞膜的通透性下降，細胞內外水腫消退，微循環障礙逐步改善；③高壓氧可加速側支循環的建立和開放，為組織提供血運和營養；④高濃度氧具有抑制細菌生長的作用，尤其對厭氧菌更明顯，同抗生素協同增加抗菌殺菌能力；還可增加吞噬細胞的功能；⑤高壓氧作用下全身各臟器供氧充足，代謝率提高，可加速有毒物質的排泄。另外，對高壓氧倉治療有禁忌的患者還可通過高氧液來進行治療。何小科等[22]利用高氧液對血管循環危象進行治療，有效率達90%。高氧液含高濃度氧，其進入循環系統后立即以溶解氧（O3）方式向組織供氧，使組織細胞由無氧代謝轉為有氧代謝。高氧液可提高紅細胞變形能力，降低血小板凝聚力，增加纖維蛋白溶解度，能調節細胞鈣離子濃度，并發揮一定的抗感染能力。

3.7 超短波治療 吳并生等[23]將超短波用于家兔肢體缺血再灌注損傷的研究，發現超短波在及早清除氧自由基和中性粒細胞中發揮作用。其機制可能與調節機體的免疫功能，通過神經體液因素使血管擴張、血流加速，并使血氧含量、pH值等內環境發生顯著變化有關。

3.8 藥物治療 藥物治療的重點包括對氧自由的清除、穩定細胞的生物膜系統、抑制鈣內流和鈣超載、改善微循環、減輕炎癥反應等幾個方面。

3.8.1 清除氧自由基及活性氧 大量實驗研究證明很多藥物可以發揮清除氧自由基的作用而減輕肢體缺血再灌注損傷。存在于細胞脂質的維生素A、維生素E及水溶性的維生素C、半胱氨酸、谷胱甘肽等均屬低分子氧自由基清除劑。維生素C分子中第2、3位兩個羥基極易釋放出氫離子，具有強力的還原性，大劑量維生素C的應用可減輕創傷后氧自由基引起的損傷[24]。依達拉奉是一種新型的抗氧化劑[25]，主要通過提供電子直接清除氧自由基，并可抑制細胞膜和線粒體膜的脂質過氧化反應。另一方面，依達拉奉也不同程度地增加了線粒體SOD的活性，增強了抗氧化能力，維持了線粒體結構和功能上的完整性，保證了細胞正常氧化磷酸化，促進了ATP合成能力的恢復。過氧化物酶可以清除H2O2避免OH-的生成。超氧化物歧化酶能特異性的催化超氧自由基發生歧化反應，有效清除氧自由基，保護細胞組織免于活性氧的損害。

3.8.2 鈣離子通道阻滯劑 實驗證實地爾硫卓、硝苯地平、氨氯地平等鈣離子通道阻滯劑既能減輕缺血性損傷，又能減輕缺血再灌注損傷[26]。其機制與鈣離子通道被阻滯，鈣離子內流受阻，細胞內鈣超載得到控制有關。但對鈣離子通道阻滯劑的研究主要集中于心肌，在肢體缺血再灌注保護中的應用較少，還有待進一步的探討。

3.8.3 改善微循環的藥物 缺血再灌注損傷發生時可出現全血粘度增高、紅細胞聚集、白細胞邊集、血管內微血管形成及無復流現象等微循環障礙的表現。在氧供不足情況下，血管內皮細胞進行無氧代謝，高能磷酸鍵持續消耗，鈉鉀泵功能受損，細胞內外水鹽失衡，溶酶體腫脹、內質網擴張明顯；氧自由基短時間爆發、脂質過氧化反應均可造成血管內皮損傷。白細胞邊集造成血管機械性阻塞，多種縮血管物質和粘附分子表達增強，血小板聚集粘附能力增強，血液粘稠度增加，微血管內徑縮窄，血流出現渦流等血液流變學改變，不及時處理就會發展為血栓形成、血管栓塞。傳統上利用低分子右旋糖酐、肝素及阿司匹林等藥物來防治缺血再灌注損傷。銀杏葉的有效成分為黃酮甙和銀杏內酯。藍旭等[27，28]通過制備家兔肢體缺血再灌注損傷模型，研究發現銀杏葉提取物可抑制血小板的活化，明顯降低血漿TXA2的水平，抑制白細胞活化和白細胞表面CD11/CD18的表達。紅花是具有通血活經、祛瘀鎮痛的臨床常用傳統中藥，經試驗表明，大劑量紅花注射液對ADP引起的血小板聚集有顯著的抑制作用，顯著降低全血粘度，影響血栓形成，表現為血栓長度縮短、形成時間延長。紅花注射液在肢體缺血再灌注損傷保護方面的研究相對較少，還有待進一步探討。

3.8.4 穩定細胞生物膜結構的藥物 肌苷是三磷酸腺苷生物合成過程中的一個前體，參與次黃嘌呤補救通路、糖原酵解供給能量，使缺血肢體中三磷酸腺苷儲備增加，維持細胞膜鈉-鉀泵的正常功能，改善細胞生物膜的通透性，維持細胞膜上較適宜的跨膜電位，從而改善組織細胞的功能，對缺血肢體起保護作用[24]。輔酶Q是磷脂酶的拮抗劑，其能通過抑制磷脂酶的活性而起穩定膜的作用[29]，輔酶Q與維生素C聯合應用可減輕缺血再灌注是紅細胞的脂質過氧化反應。牛磺酸是一種游離氨基酸，在骨骼肌和心肌中含量高，體內重要的內源性抗損傷物質，具有穩定細胞膜結構、防止鈣離子內流，調節胞內鈣穩態及清除自由基等多種細胞保護作用，從而減輕缺血再灌注損傷，它的穩膜作用機制可能與抗自由基有關[30]。地塞米松對中性粒細胞功能具有強力的抑制作用，抑制中性粒細胞活化及對血管內皮細胞的粘附和游出。這樣，一方面降低了中性粒細胞的機械性阻塞，降低了微血栓形成及阻塞毛細血管和微動靜脈的概率，從而減輕繼發性無復流現象的發生；另一方面，抑制了中性粒細胞的活化，也就抑制了激活的中性粒細胞釋放的一系列血管活性物質和炎性因子，同時抑制了中性粒細胞的“呼吸爆發”抑制了大量氧自由基的生成。大量炎性因子的釋放和氧自由基的生成是缺血再灌注損傷發生的重要因素之一。Dolan等[31]研究表明，地塞米松還直接抑制中性粒細胞游出和中性粒細胞的氫過氧化物生成，阻止磷脂酶A2和花生四烯酸代謝，從而抑制生物膜脂質過氧化反應的發生，減輕中性粒細胞介導的缺血再灌注損傷。何賢清等[32]經實驗證實，地塞米松能有效地維持缺血再灌注組織微循環中各級血管壁的完整性，改善微循環血流，保護內皮細胞免受損傷。

3.8.5 抗炎藥物 前列環素E1可提高CAMP水平，而發揮抑制炎癥介質釋放、抑制白細胞對血管內皮細胞的粘附。前列環素E1還可抑制血小板聚集，擴張血管，穩定細胞膜結構。

3.8.6 其他 CO可抑制巨噬細胞和單核細胞的轉移浸潤，抑制TNF-α的表達，抑制血小板和白細胞的聚集和IL-18介導的炎性反應，抑制超氧化物的生成和溶酶體的釋放。CO還可阻止細胞外鈣離子的內流，減輕細胞鈣超載，延緩缺血損傷引起的線粒體腫脹，并有血管擴張作用，對改善骨骼肌的血液循環有積極作用[33，34]。

臨床上，肢體缺血再灌注性疾病日益增多，導致病殘率和致死率亦日漸增高，給患者生理心理和經濟等各方面帶來了沉重壓力。通過臨床和動物實驗來探討多種方法的聯合治療，以及新方法的應用，將對肢體缺血再灌注后肢體功能的恢復和減少病殘率和致死率起到積極的意義。

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