由乳酸菌制備維生素B類化合物的研究進展

夏亞穆,杜康健,夏 軍(青島科技大學化工學院,山東青島266042)

由乳酸菌制備維生素B類化合物的研究進展

夏亞穆,杜康健,夏 軍
(青島科技大學化工學院,山東青島266042)

維生素B類化合物是人體必需物質(zhì),主要通過外源性的食物或藥物來補充。選育得到的乳酸菌能產(chǎn)生天然的人體易于吸收的不同類型維生素B。介紹了近年來通過乳酸菌生物合成維生素B類化合物的研究進展,為進一步研究產(chǎn)維生素B類化合物乳酸菌菌種選育和代謝工程改造提供參考。

乳酸菌;維生素B類化合物;代謝工程

1 前言

維生素B類化合物是人體正常代謝的必需物質(zhì),大部分不能由人體自身產(chǎn)生,很多人由于膳食營養(yǎng)不平衡、吸收效率低而導致維生素B缺乏進而引起疾病,須通過外源性的維生素B營養(yǎng)食品或者藥物來補充。目前,維生素B類化合物的工業(yè)化生產(chǎn)方法主要有微生物發(fā)酵法和化學合成法[1,2],其中化學合成法路線設計復雜、副產(chǎn)品多、難以提純,而微生物發(fā)酵法成本低廉、生產(chǎn)工藝簡單、環(huán)境友好,尤其是利用乳酸菌合成維生素B類化合物的方法具有廣闊的發(fā)展空間和應用前景,已成為研究的熱點。

乳酸菌是發(fā)酵糖類主要產(chǎn)物為乳酸的一類無芽孢、革蘭氏染色陽性細菌的總稱,其成分相當龐雜,目前至少可分為18個屬,共有200多種[3]。許多乳酸菌發(fā)酵能產(chǎn)生維生素B類化合物,而且不同的菌種能夠選擇性產(chǎn)生不同種類的維生素B。作者在此介紹了近年來由乳酸菌制備維生素B2、B9、B12及其它B族維生素的研究進展。

2 由乳酸菌制備維生素B類化合物

2.1 由乳酸菌制備維生素B2

維生素B2又稱核黃素,在細胞代謝中發(fā)揮著重要的作用。核黃素缺乏會導致口腔、唇等部位的炎癥和機能障礙。核黃素存在于奶制品和動物肝臟等食物中,通常以黃素單核苷酸(FMN)和黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)輔酶形式和蛋白質(zhì)結(jié)合存在,人體對其生物利用度遠低于游離態(tài)核黃素[4],而乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的核黃素大部分是游離態(tài),因此,通過選育產(chǎn)核黃素乳酸菌菌株并將其用于發(fā)酵食物,可有效解決人體每天攝入核黃素不足的問題。

Capozzi等[5]利用自發(fā)抗玫瑰黃色素突變體選擇法從小麥面粉中篩選到了乳酸菌,分離出2種能夠產(chǎn)生大量維生素B2的植物乳酸桿菌菌株。將篩選得到的菌株用于面包制作,高效液相色譜分析結(jié)果表明面包中核黃素的含量增加了3倍。

Jayashree等[6]從印度韋洛爾地區(qū)的幾種奶制品中篩選出48株菌株,其中乳酸桿菌MTCC8711發(fā)酵后能產(chǎn)生大量核黃素,在培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h可生成2.29 mg·L-1的核黃素。該菌株通過改造,有望成為發(fā)酵食品產(chǎn)業(yè)中一種很好的發(fā)酵劑來提高食品中核黃素的產(chǎn)量。

利用代謝工程技術是獲得產(chǎn)核黃素乳酸菌菌株的另一條途徑。Burgess等[7]以雷特氏乳酸球菌亞種NZ9000為對象,對其中的rib操縱子進行基因互補實驗和缺失分析實驗以考察其各個部分在生物合成過程中的作用,然后通過基因特異性實驗來檢測rib操縱子中哪些基因過表達后可以提高核黃素產(chǎn)量。結(jié)果表明,當乳酸菌的ribG、rib H、ribB、ribA 4種基因全表達時,其發(fā)酵產(chǎn)物中核黃素的含量很高,達到24 mg· L-1。

基因工程技術的一個重要優(yōu)勢是能夠獲得穩(wěn)定遺傳并擁有多種功能的菌株。Sybesma等[8]以雷特氏乳酸球菌亞種NZ9000為對象,經(jīng)過基因突變選育使其由核黃素消耗菌株轉(zhuǎn)變?yōu)楹它S素生產(chǎn)菌株,基因分析發(fā)現(xiàn)這是因控制核黃素合成基因的上游調(diào)控區(qū)中有一對堿基發(fā)生變化導致的;同時,增加乳酸菌中GTP環(huán)水解酶Ⅰ(葉酸生物合成途徑中的關鍵酶之一)的量,發(fā)酵產(chǎn)物中葉酸含量提高。

2.2 由乳酸菌制備維生素B9

維生素B9又稱葉酸,是機體細胞生長和繁殖所必需的物質(zhì)。人類缺乏葉酸可引起巨紅細胞性貧血以及白細胞減少等多種疾病,孕婦對葉酸的需求量比正常人高4倍,當葉酸缺乏時,可導致胎兒體重低、唇腭裂、心臟缺陷等。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),通過選育產(chǎn)葉酸乳酸菌菌株,并將其用于發(fā)酵食品,可滿足人體對葉酸的需求。

LeBlanc等[9]研究發(fā)現(xiàn),乳酸乳球菌和嗜熱鏈球菌能夠大量產(chǎn)生葉酸,嗜酸性乳酸桿菌和植物乳酸桿菌等也能產(chǎn)生葉酸;Santos等[10]研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)過代謝工程改造的羅伊氏乳酸桿菌JCM1112能產(chǎn)生大量葉酸。劉友群等[11]對嗜酸性乳酸桿菌及乳酸乳球菌發(fā)酵合成葉酸的影響因素進行了研究。結(jié)果表明,乳酸菌代謝合成葉酸的產(chǎn)率為17～100μg·L-1,菌種、培養(yǎng)時間、p H值、對氨基苯甲酸(PABA)質(zhì)量濃度均會影響乳酸菌合成葉酸的產(chǎn)量。與乳酸乳球菌亞種相比,嗜酸性乳酸桿菌CH-2的葉酸產(chǎn)量更高;在培養(yǎng)基中加入PABA可加快葉酸的合成,提高發(fā)酵液中葉酸的含量。

研究表明,在蔬菜發(fā)酵過程中通過選擇合適的乳酸菌作發(fā)酵劑也能夠得到大量的5-甲基四氫葉酸[12]。在10種不同的乳酸菌培養(yǎng)基中,其中一種培養(yǎng)基能得到原來2倍量的葉酸,這些葉酸是天然的,生物利用度高。

Pompei等[13]選取76株乳酸菌類的雙歧桿菌,在無葉酸的半合成的培養(yǎng)基SM7中分別培養(yǎng),結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中17株菌株不需葉酸就能生長,有6株可以產(chǎn)生較多的葉酸(41～82 ng·m L-1)。

在乳酸乳球菌[14]、植物乳酸桿菌[15]和德氏乳酸桿菌保加利亞變種[16]中控制葉酸生物合成的基因已經(jīng)被鑒定。但并非每種乳酸桿菌屬都能夠產(chǎn)生葉酸,如加氏乳酸桿菌[17]、唾液乳酸桿菌[18]、約氏乳酸桿菌[16]等。

Hugenholtz等[19]研究發(fā)現(xiàn),乳酸菌釋放到體外的葉酸的量和其體內(nèi)單谷酰葉酸與多谷酰葉酸的比例有關。通過從人體或老鼠體內(nèi)獲得能表達γ-谷酰基水解酶的基因片段,在Nisin調(diào)控表達系統(tǒng)(NICE System)中進行互補DNA克隆,然后引入到乳酸乳球菌中表達,使多谷酰葉酸水解成單谷酰葉酸,從而使乳酸菌釋放更多葉酸。

利用代謝工程技術可以提高乳酸乳桿菌[14,20]、格氏乳酸桿菌[17]和羅伊氏乳酸桿菌[10]的葉酸產(chǎn)量。通過控制乳酸桿菌中fol KE基因的超表達來編碼6-羥甲基-二氫嘌呤焦磷酸激酶(fol K)和GTP環(huán)水解酶(folE)可使細胞外葉酸產(chǎn)量提高10倍,總?cè)~酸產(chǎn)量提高3倍;與此同時,fol A基因超表達的二氫葉酸還原酶可使葉酸總產(chǎn)量下降50%。除此之外,已經(jīng)檢測到fol KE和fol C超表達的結(jié)合有利于胞內(nèi)葉酸的積累[21]。另外,GTP環(huán)水解酶的超表達可能具有提高葉酸產(chǎn)量的潛力。總之,fol KE超表達與其它葉酸生物合成基因表達的適當結(jié)合能夠顯著提高葉酸的產(chǎn)量,并且這些基因修飾的乳酸菌和天然菌株一樣安全[22]。

Wegkamp等[17]將消耗葉酸的格氏乳酸桿菌ATCC33323改造成了高效的葉酸生產(chǎn)菌株。在該菌株中,除了fol A和fol C基因外不存在其它葉酸生物合成基因,而fol A和fol C基因參與了從外界中攝取葉酸的再生和保留。將乳酸乳球菌MG1363中含有完整葉酸基因簇(fol A、fol B、fol KE、fol P、ylgG和fol C)的質(zhì)粒引進到格氏乳酸桿菌ATCC33323中,經(jīng)過重組的菌株即轉(zhuǎn)變成葉酸生產(chǎn)菌株。

乳酸菌發(fā)酵得到的天然葉酸與化學合成的葉酸相比,不會掩蓋由維生素B12缺乏而導致神經(jīng)系統(tǒng)受損所引起的病癥[23]。這就使得選育高產(chǎn)葉酸的乳酸菌菌株、提高發(fā)酵食物中葉酸含量的研究更有意義。

2.3 由乳酸菌制備維生素B12

維生素B12是所有呈現(xiàn)氰鈷胺素生物活性的類咕啉的總稱。人體如缺乏維生素B12會引起造血系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)疾病。目前,維生素B12主要是由費氏丙酸桿菌、脫氮假單胞菌等微生物合成得到,但生產(chǎn)成本高、價格昂貴,因此進一步研究、選育優(yōu)良的產(chǎn)維生素B12菌株,對降低維生素B12生產(chǎn)成本十分重要。

一些乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)物中含有維生素B12。Taranto等[24]研究表明,乳酸菌中羅伊氏乳酸桿菌CRL1098在無維生素B12培養(yǎng)基中可以利用甘油合成1,3-丙二醇,而此代謝過程中必定會有維生素B12作為輔酶參與反應,這就證明乳酸菌類微生物可以生成維生素B12。對羅伊氏乳酸桿菌CRL1098胞內(nèi)提取物的色譜分析證實,該菌株可產(chǎn)生類似維生素B12的復合物,該復合物的吸收光譜除洗脫時間不同外,其它特征均與維生素B12極其相似。Santos等[10,25]發(fā)現(xiàn)羅伊氏乳酸桿菌DCM20016、JCM1112、CRL1324和CRL1327也能夠產(chǎn)生一些類咕啉物質(zhì)。Molina等[26]研究表明:羅伊氏乳酸桿菌CRL1098產(chǎn)生的維生素B12類似物具有生物活性,可以有效避免由于缺乏維生素B12而引起的病癥。上述研究表明羅伊氏乳酸桿菌可能含有合成維生素B12的基因。Santos等[27]通過表達和鈍化編碼PocR蛋白的基因而證實此蛋白就是控制維生素B12合成的關鍵。

Madhu等[28]利用從印度食物Kanjikad中提取的植物乳酸桿菌細胞內(nèi)合成維生素B12,經(jīng)96 h的深層發(fā)酵得到維生素B1213 ng·(g培養(yǎng)基干重)-1;用氰化鈉細胞裂解液溶解細胞,再用芐醇-氯仿-水體系進行萃取,即可提取出細胞內(nèi)的維生素B12。

利用基因突變和基因工程技術[29,30]可有效提高費氏丙酸桿菌的維生素B12產(chǎn)量,但針對乳酸桿菌的類似研究還未開展過。了解產(chǎn)維生素B12的乳酸菌的復合基因序列將有助于設計相應的策略用于選育高產(chǎn)維生素B12的優(yōu)化菌株[31,32]。

2.4 由乳酸菌制備其它B族維生素

乳酸菌除了能制備維生素B2、B9和B12外,還能制備其它B族維生素,但相關研究的報道較少[33,34]。

乳酸菌中雙歧桿菌使得豆奶中維生素B1的含量提高了11%[35]。利用嗜熱鏈球菌ST5和瑞士乳酸桿菌R0052或長雙歧桿菌R0175發(fā)酵大豆,維生素B1和B6的含量均得以提高[36]。這是首次利用純的瑞士乳酸桿菌和嗜熱鏈球菌培養(yǎng)基來研究發(fā)酵飲料中維生素B1和B6的含量。

3 結(jié)語

通過對乳酸菌類微生物菌種和培養(yǎng)條件的共同選擇可提高發(fā)酵食品中不同維生素B類化合物的含量、改善食品的品質(zhì),獲得良好的經(jīng)濟效益。隨著乳酸菌基因測序和新型工程技術的發(fā)展,利用價廉易得的乳酸菌菌株制備富含維生素B類化合物產(chǎn)品的潛力很大。

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Research Progress of B-Group Vitamins Produced by Lactic Acid Bacteria

XIA Ya-mu,DU Kang-jian,XIA Jun
(College of Chemical Engineering,Qingdao University of Science and Technology,Qingdao 266042,China)

B-Group vitamins are a group of human essential substances that play important roles in cell metabolism.They can be externally obtained from food and medicine.Most lactic acid bacteria(LAB)can produce B-group vitamins which are natural,various and easy to be absorbed in human body.This review shows current research progress of B-group vitamins produced by LAB.It provides some references for the study of screening LAB strains and for the improvement of the metabolic engineering.

lactic acid bacteria;B-group vitamins;metabolic engineering

TQ 924

A

1672-5425(2012)11-0005-04

10.3969/j.issn.1672-5425.2012.11.002

山東省自然科學基金資助項目(ZR2010HM023),高等學校博士學科點專項科研基金資助項目(20093719120004)

2012-07-16

夏亞穆(1974-),男,甘肅天水人,副教授,主要從事生物活性物質(zhì)的提取、分離、合成等研究與開發(fā)工作,E-mail:xiayamu @qust.edu.cn。