腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白2在過敏性鼻炎小鼠模型中的表達(dá)及與血管生成的關(guān)系

王 敏 楊 軍 尚 軍 張 羅*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，北京100730;2.北京市耳鼻咽喉科研究所基礎(chǔ)室，耳鼻咽喉頭頸科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100005;3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，北京100730)

過敏性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是鼻科常見病之一，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量，并且與哮喘、鼻竇炎和呼吸道感染等多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)。

近期研究［1-2］表明呼吸道重塑是過敏性鼻炎的重要特征。呼吸道重塑可導(dǎo)致呼吸道結(jié)構(gòu)性變化，包括平滑肌肥大，杯狀細(xì)胞增生、上皮下纖維化、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和血管生成增多。其中血管生成在呼吸道重塑中起著關(guān)鍵作用［3］。目前比較明確在過敏性鼻炎中參與血管生成的因子有血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和血小板來源的生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor，PDGF)［3-4］。

腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白2(tumor necrosis factor-α-inducible protein-2，TNFAIP2)，又稱 B94，最早發(fā)現(xiàn)是內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)TNF α刺激后表達(dá)的主要基因［5］。隨后的研究［6-7］顯示多種細(xì)胞經(jīng)過多種物質(zhì)刺激后均可誘導(dǎo)TNFAIP2的表達(dá)。目前認(rèn)為TNFAIP2與多種腫瘤的形成有關(guān)［8-10］，且功能主要是影響血管生成［8］。但是，血管生成因子 TNFAIP2在過敏性鼻炎中的作用目前尚不清楚，本研究將對(duì)此進(jìn)行探討，以期加深對(duì)AR發(fā)病機(jī)制的理解，并為AR治療靶點(diǎn)的選擇提供重要理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 建立卵清蛋白(ovalbumin，OVA)誘導(dǎo)的過敏

性鼻炎小鼠模型的建立

用BALB/c小鼠進(jìn)行AR動(dòng)物模型的建立，具體建模方案參考文獻(xiàn)［11］并作簡(jiǎn)單修改。在1 d和7 d用含50 μg OVA和5 mg Al(OH)3佐劑的0.9%氯化鈉注射液400 μL進(jìn)行致敏(i.p.)。1周后連續(xù)3周每周 3 d(14～35 d)鼻局部給予含 50 μg OVA的0.9%氯化鈉注射液20 μL方式進(jìn)行激發(fā)。最后一次激發(fā)2 h后處理小鼠收集血清和鼻黏膜，一部分鼻黏膜用于提取RNA，另一部分過夜固定用于免疫組織化學(xué)分析。上述為實(shí)驗(yàn)組，即OVA組。對(duì)照組，用0.9%氯化鈉注射液代替OVA致敏和激發(fā)。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各6只小鼠。具體見圖1。

圖1 過敏性鼻炎小鼠的建模方案Fig.1 Experimental protocol of allergic rhinitis mouse model

1.2 鼻部癥狀與ELISA檢測(cè)

最后一次激發(fā)后立即計(jì)數(shù)20 min內(nèi)撓鼻和噴嚏的次數(shù)。血清中OVA特異性IgE用ELISA法檢測(cè)，具體方法參考文獻(xiàn)［12］。

1.3 實(shí)時(shí)定量 PCR檢測(cè)

鼻黏膜組織總RNA用Trizol提取，用oligo(dt)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。實(shí)時(shí)定量PCR儀器為Rotor-GeneTM6200 HRM(Corbett Life Science，Sydney，Australia)。Platinum SYBR Green qPCRSuperMixUDG購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。小鼠TNFAIP2引物QuantiTect Primer Assay QT00154812購(gòu)自德國(guó) Qiagen公司，小鼠CD31的引物序列參考文獻(xiàn)［13］;看家基因GAPDH的引物序列參考文獻(xiàn)［14］。結(jié)果用delta delta Ct法分析。

1.4 組織學(xué)分析

鼻黏膜組織用10%的中性甲醛固定，然后石蠟包埋，切成厚度為4 μm的切片。HE染色用于觀察嗜酸細(xì)胞，甲苯胺藍(lán)染色用于觀察肥大細(xì)胞，免疫組化染色用于觀察TNFAIP2的表達(dá)。一抗TNFAIP2抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司，HRP標(biāo)記的二抗和底物DAB購(gòu)自北京中杉金橋公司。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉ±s)表示，組間比較用t-test。相關(guān)性采用Pearson相關(guān)系數(shù)描述。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 過敏性鼻炎小鼠模型

過敏性鼻炎小鼠的撓鼻癥狀和血清OVA-specific IgE水平均顯著高于對(duì)照小鼠，且鼻黏膜組織中有明顯的嗜酸細(xì)胞和肥大細(xì)胞浸潤(rùn)，表明過敏性鼻炎小鼠動(dòng)物模型已成功建立(圖2)。

2.2 過敏性鼻炎小鼠中TNFAIP2基因的表達(dá)

過敏性鼻炎小鼠鼻黏膜中TNFAIP2基因的表達(dá)比對(duì)照小鼠顯著升高(P＜0.01，圖3)。

2.3 過敏性鼻炎小鼠中TNFAIP2蛋白的表達(dá)

對(duì)照小鼠鼻黏膜僅有少量TNFAIP2蛋白表達(dá)，而過敏性鼻炎小鼠中TNFAIP2蛋白的表達(dá)顯著升高，而且在上皮層和皮下均有表達(dá)(圖4)。

2.4 過敏性鼻炎小鼠中CD31基因的表達(dá)及其與TNAFIP2的相關(guān)性

過敏性鼻炎小鼠鼻黏膜中CD31基因的表達(dá)也比對(duì)照小鼠顯著升高(P＜0.05)，且鼻黏膜中CD31和TNFAIP2基因的表達(dá)存在顯著正相關(guān)(r=0.6399，P=0.025，圖 5)。

3 討論

鼻黏膜局部反應(yīng)的研究往往比全身系統(tǒng)反應(yīng)的研究更能反映疾病的本質(zhì)。然而，由于過敏性鼻炎患者的鼻黏膜組織正常情況下無法獲得，限制了對(duì)此疾病局部反應(yīng)的研究。過敏性鼻炎小鼠模型的建立解決了這一難題，本課題組通過建立OVA誘導(dǎo)的過敏性鼻炎小鼠模型對(duì)鼻黏膜局部TNFAIP2的表達(dá)進(jìn)行了觀察。

鼻部癥狀的出現(xiàn)、過敏原特異性IgE的產(chǎn)生、嗜酸細(xì)胞和肥大細(xì)胞的浸潤(rùn)是過敏性鼻炎的重要特征［15］。與此一致，筆者用OVA致敏和激發(fā)的小鼠其撓鼻次數(shù)、OVA特異性IgE濃度和鼻黏膜局部嗜酸細(xì)胞和肥大細(xì)胞的聚集均明顯高于正常對(duì)照，表明過敏性鼻炎小鼠模型建模成功。

圖2 過敏性鼻炎小鼠模型的特征Fig.2 Characteristic of allergic rhinitis mouse model

圖3 過敏性鼻炎小鼠鼻黏膜上皮組織TNFAIP2基因的表達(dá)Fig.3 Expression of TNFAIP2 gene in nasal mucosa

本研究發(fā)現(xiàn)過敏性鼻炎小鼠鼻黏膜局部TNFAIP2的表達(dá)顯著升高。血管生成是過敏性鼻炎鼻黏膜組織重塑的重要特征之一，過敏性鼻炎患者鼻組織血管生成因子VEGF和PDGF表達(dá)水平顯著升高［16-17］，應(yīng)用血管生成因子VEGF和PDGF受體阻斷劑可改善過敏性鼻炎小鼠鼻氣道重塑［3］。TNFAIP2也與血管生成有關(guān)，早期研究［18］發(fā)現(xiàn)血管生成的體外模型中TNFAIP2表達(dá)顯著升高。另外，近期在鼻咽癌研究［8］中發(fā)現(xiàn)TNFAIP2的表達(dá)與微血管的密度相關(guān)。CD31是血管內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志分子，本研究中過敏性鼻炎小鼠鼻黏膜同樣高表達(dá) CD31，且與 TNFAIP2基因的表達(dá)相關(guān)。因此，TNFAIP2很可能通過影響血管生成參與了過敏性鼻炎的發(fā)生。

總之，本研究結(jié)果提示TNFAIP2可能參與了過敏性鼻炎的發(fā)生，且可能與血管生成相關(guān)，但具體機(jī)制如何，還有待進(jìn)一步探討。

圖4 過敏性鼻炎小鼠鼻黏膜上皮組織TNFAIP2免疫組化染色結(jié)果Fig.4 Expression of TNFAIP2 protein in nasal mucosal(400×)

圖5 CD31基因的表達(dá)及其與TNFAIP2的相關(guān)性Fig.5 Expression of CD31 and correlation between CD31 and TNFAIP2

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